Kromatografi analizlerinde pik bölünmesi ve pik omuzlanması nasıl önlenir?

6 Ağu 2020

Pik bölünmesi (peak splitting) ve pik omuzlanması (peak fronting) yüzünden geceleri gözünüze uyku girmiyor mu?

Mükemmel kromatogram piklerinin yalnızca güzel birer hayal olduğunu mu düşünüyorsunuz? Aslında onları gerçekten elde edebilirsiniz! Kromatogramınızı bozabilecek birkaç çirkin pik türünü ele almanın zamanı geldi. Talihsiz birer kromatogram fenomeni olan pik omuzlanması (peak fronting) ve pik bölünmesi (peak splitting) durumlarından güzel pikler elde etmek üzere nasıl kurtulacağınızı öğrenmek için okumaya devam edin.

Eşim geçen gece avazı çıktığı kadar bağırarak soğuk terler içinde uyandı. Kadıncağız korkunç bir kabus görmüş. Yalnızca kemiklerden ve atan bir kalpten oluşan bir tavuk bahçede ordan oraya koşuşturuyormuş. Ben de kendi kabuslarımı anlatarak onu sakinleştirmeye çalıştım, ama işe yaramadı. Her nasılsa bunu kemikten yapılmış tavuğu kadar korkunç bulmadı.

Tamam tamam, sanırım bu biçimsiz ve çirkin pikler sadece kromatografiye özgü korkunçluklar. Ama onları benim kadar korkunç buluyorsanız ve bu kötü rüyaların gerçeğe dönüşmesini istemiyorsanız, size bu konuda yardımcı olup olamayacağımı görmek için okumaya devam edin.

Son kromatografi postunda kromatogramlardaki pik kuyruklanması (peak tailing) ve bunun önüne nasıl geçilebileceğinden bahsetmiştim. Ama o zaman da bahsettiğim gibi, pik simetrisi arayışınızda savaşmanız gereken başka kötü etkiler de var. Bu yazıda, pik omuzlanması ve pik bölünmesinin nedenlerine ve çözümlerine odaklanmak istiyorum.

Kromatografide pik omuzlanması ile başlayalım, ne dersiniz?

Pik omuzlanması pik kuyruklanmasına göre daha seyrek olur, ancak meydana geldiğinde aşağıdaki şekildeki gibi görünür:

Pik omuzlanmasının nedenlerinden biri kolonun aşırı yüklenmesidir.

Bir kolonun belirli bir maksimum numune kapasitesi vardır. Bu maksimum değer aşılırsa, ilave moleküller sabit ve mobil faz arasında ayrışamaz. Bu nedenle, kolondan daha hızlı elüsyon olur ve pik omuzlanmasına neden olabilirler. Pik omuzlanmasını azaltmak veya ortadan kaldırmak için kolona yüklediğiniz numune miktarını azaltmayı deneyebilirsiniz.

Pik omuzlanmasının bir başka nedeni, numune solventi ile mobil faz arasındaki uyumsuzluktur. Bu sorunun üstesinden gelmek için numuneyi mobil fazda çözmeyi deneyebilirsiniz. Alternatif olarak, katı bir yükleme yaklaşımı kullanarak numuneyi kromatografi sisteminize dahil edebilirsiniz, çünkü bu yöntem numune çözücü gerektirmez. Numune yükleme teknikleri hakkında daha fazla bilgi için ücretsiz Chromapedia Vol 2 kılavuzunu inceleyebilirsiniz.

Artık pik omuzlanmasını anladığımıza göre üçüncü ve son bir kabus senaryosuna bakalım: pik bölünmesi. Pik bölünmesi, kromatografi sistemi tarafından püskürtüldüğünde aşağıdaki gibi görünen biçimsiz piklerdir:

Kromatogramınızda pik bölünmesi fark ettiğinizde, öncelikle pik bölünmesini sadece bir ya da iki pikte mi yoksa neredeyse tüm piklerde mi gözlemlediğinizi kontrol etmelisiniz.

Yalnızca tek bir pik etkilenmişse, pik bölünmesi muhtemelen kimya ve gerçek separasyon ile ilgili bir problemden kaynaklanmaktadır. Olası bir çözüm, mobil faz koşullarını optimize etmeniz olacaktır. Bu, pik bölünmesini düzeltmezse, ayırmayı iyileştirmek için başka bir sabit faz seçmeyi deneyin. Mobil ve sabit fazları nasıl optimize edeceğinize dair birkaç fikre daha önceki yazılarımdan ulaşabilirsiniz.

Piklerinizin çoğu veya tümü etkilenmişse, pik bölünmesi muhtemelen kolonla ilgili sorunlardan kaynaklanmaktadır. Örneğin, kolonun girişinde bir boşluğun varlığı veya paketleme yatağında kanal olması, pik bölünmesine neden olabilir. Önceden paketlenmiş bir kartuş kullanıyorsanız, bu sorunu çözmenin tek yolu yeni bir kartuş kullanmaktır. Daha önce de yazdığım gibi, bu durum ihtiyaçlarınız için en uygun kartuşu kullanıp kullanmadığınızı kontrol etmek için iyi bir zaman olabilir. Karar verme sürecinize yardımcı olmak için geliştirdiğimiz kartuş seçim aracını inceleyebilirsiniz.

Kısmen tıkalı giriş fritleri de pik bölünmesine neden olabilir. Bu etkiyi ortadan kaldırmak için kolona yüklemeden önce numunelerinizi filtreden geçirmeyi deneyebilirsiniz. Alternatif olarak, pik bölünmesini önlemek için bir katı yükleme enjeksiyon tekniği kullanabilirsiniz.

Umarım bu yazı, kromatografi kullanıcılarının kabusu olan pik bölünmesi ve pik omuzlaması için bir düş kapanı olabilir, böylece bu etkileri kromatogramlarınızdan ve kötü rüyalarınızdan çıkarmış olursunuz.

Sizi bütün gece uyanık tutan başka kromatografi problemleri var mı? Bu konuda size yardımcı olmamız için bizimle iletişime geçebilirsiniz.

Bir dahaki sefere kadar,

Bart Denoulet

Kaynak: https://www.barts-blog.net/are-peak-splitting-and-peak-fronting-effects-keeping-you-up-at-night/

Takip Et

Facebook

Twitter

Instagram

YouTube

Paylaş

Facebook

Twitter

Bunları da beğenebilirsiniz!

Kullanılmış Maskeler Mikroplastik Riski Oluşturuyor

Bilim insanları, tek kullanımlık maskelerin çevre için önemli ölçüde mikroplastik riski oluşturabileceği konusunda uyarıyor ve atıkların bertarafı için gelişmiş stratejilere acil bir ihtiyaç olduğunu vurguluyor.

19 Ağu 2021

Devamı...

Nükleik Asitler Nasıl Saflaştırılır?

Yeni bir laboratuvar kurma sürecinde nükleik asit saflaştırma için neye ihtiyacınız olduğunu mu merak ediyorsunuz? Yoksa numunelerinizin aşağı akış uygulamanız için yeterince saf olmadığını mı fark ettiniz? Öyleyse doğru yerdesiniz. Bu makale, “Numunelerden Saf Nükleik Asitlere” serimizin dördüncü ve son bölümünü oluşturuyor. Nükleik asit ekstraksiyonu, bir PCR laboratuvarı kurulumu ve nükleik asit miktar tayini ve görselleştirme konularını ele aldıktan sonra, şimdi farklı saflaştırma yöntemlerinden bahsedeceğiz. Her tekni

5 Ağu 2021

Devamı...

Nükleik Asitlerin Saflık ve Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Nükleik asitlerin örneklerden saflaştırılması moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın bir iş akışıdır. Doğru kararları almanıza yardımcı olmak için bir laboratuvar kurarken ve ekipman satın alırken nelere dikkat etmeniz gerektiğini açıklayan dört bölümlük bir dizi hazırladık. Nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerini ve bir PCR laboratuvarının nasıl kurulduğunu anlattıktan sonra, şimdi nükleik asitlerin konsantrasyonunu, verimini ve saflığını belirlemek için farklı yöntemlere göz atacağız.

27 Tem 2021

Devamı...

Bir PCR Laboratuvarı Nasıl Kurulur?

Yeni bir laboratuvar kurmak heyecan verici olduğu kadar göz korkutucu bir süreç olabilir. Kendisine bir laboratuvar kurmak için yakın zamanda bu zorlukla yüzleşen INTEGRA, süreçten öğrendiklerini bu dört bölümlük dizide bir araya getirdi. Birinci bölümde nükleik asit ekstraksiyonu için neyin gerekli olduğu tartışıldıktan sonra, şimdi polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) gerçekleştirirken nelerin dikkate alınması gerektiğine bakılacak.