Bir PCR Laboratuvarı Nasıl Kurulur

Bir PCR Laboratuvarı Nasıl Kurulur?

Yeni bir laboratuvar kurmak heyecan verici olduğu kadar göz korkutucu bir süreç olabilir. Kendisine bir laboratuvar kurmak için yakın zamanda bu zorlukla yüzleşen INTEGRA, süreçten öğrendiklerini bu dört bölümlük dizide bir araya getirdi. Birinci bölümde nükleik asit ekstraksiyonu için neyin gerekli olduğu tartışıldıktan sonra, şimdi polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) gerçekleştirirken nelerin dikkate alınması gerektiğine bakılacak.

İçindekiler:

1- PCR, qPCR ve RT-PCR testleri nasıl çalışır?
2- PCR laboratuvarı tasarlama
3- PCR ekipmanı için ipuçları
3.1- Laminer akış veya biyogüvenlik kabini
3.2- Pipet uçları ve diğer sarf malzemeleri

4- Temizlik ve kontaminasyon kontrolü
5- Sonuçlar
 
 












1- PCR, qPCR ve RT-PCR nasıl çalışır?

Gerçek zamanlı ve ters transkripsiyonlu PCR, genellikle "RT-PCR" olarak kısaltılır ancak bunlar aynı şey değildir. Hepimizin aynı şeyi anladığından emin olmak için her bir tekniği daha detaylı incelemeden önce PCR, qPCR ve RT-PCR kısaltmaları arasındaki farklara kısaca değinelim:

PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA segmentlerini amplifiye etmek için kullanılan hızlı ve uygun maliyetli bir tekniktir. İlk olarak, numune ısıtılır, böylece DNA denatüre olur (iki tek sarmala ayrılır). Sıcaklık, DNA'nın tamamlayıcı bir kopyasını oluşturmasını sağlayacak şekilde polimeraz enziminin optimum çalışma sıcaklığına yükseltilmeden önce, oligonükleotitlerin tek sarmallı DNA'nın belirli bölümleriyle birleşmesine izin vermek için düşürülür. Teorik olarak, bu adımların bir kez tekrar edilmesi veya “termal döngüsü” reaksiyonda bulunan spesifik DNA miktarını iki katına çıkarır. Başlangıçta bulunan DNA miktarına ve PCR sonrası uygulamalar için gereken amplikon kopyalarının sayısına bağlı olarak, genellikle 25 ila 40 döngü gerçekleştirilir.

İlginç bir bilgi: PCR'lerde genel olarak kullanılan polimeraz enzimi, orijinal olarak Thermus aquaticus bakterisinden izole edildiğinden Taq-polimeraz olarak adlandırılır. İlk olarak 1960'larda Yellowstone Milli Parkı'ndaki bir sıcak su kaynağında keşfedilen bu enzim, DNA denatürasyonu için gerekli olan yüksek sıcaklıklara dayanabilir.

qPCR: Gerçek zamanlı PCR, kantitatif PCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR olarak da adlandırılan qPCR, hedef nükleik asitlerin üretilirken amplifikasyonunu saptamak ve ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Geleneksel PCR'lerin aksine, qPCR'ler, floresan olarak etiketlenmiş bir oligonükleotid probu ve floresanı ölçebilen ve eşik döngüsü (CT) değerini hesaplayabilen bir termocycler (ısı döngüleyici) gerektirir. Tipik olarak, floresan, oluşan PCR ürününün konsantrasyonuyla doğru orantılı olarak artar, bu da hedef miktarların gerçek zamanlı olarak ölçülmesine olanak tanır.

RT-PCR: Ters (reverse) transkriptaz PCR (RT-PCR), haberci RNA (mRNA) ve viral RNA genomları gibi RNA hedef dizilerini kopyalamak için kullanılır. Bu tip PCR, PCR amplifikasyonundan önce numune RNA'sının bir ters transkriptaz enzimi ve bir DNA primeri (diziye özgü, oligo dT veya rastgele heksamer) ile ilk inkübasyonunu içerir.

RT-PCR kısaltması bazen ters (reverse) transkriptaz PCR'si yerine gerçek zamanlı PCR için de kullanılır. Gerçek zamanlı PCR, kantitatif PCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR olarak da adlandırıldığından, gerçek zamanlı PCR'ın qPCR olarak kısaltılması gerektiğini düşünüyoruz.
 
PCR reaksiyonları çok hassastır ve çok küçük miktarlardaki başlangıç materyalinden çok sayıda nükleik asit kopyası oluşturur. Bu nedenle PCR reaksiyonları, temel ve oldukça etkili moleküler biyoloji teknikleridir. Ancak, amplikon ve numune kontaminasyonuna yatkın oldukları için, PCR laboratuvarı alanının planlanması ve tasarımının dikkatli bir şekilde yapılması gerekir.
 

2- PCR laboratuvarı tasarlama

İdeal olarak, bir PCR laboratuvarında, her biri belirli görevler için tasarlanmış iki alana sahip iki oda olmalıdır. İlk oda, yalnızca PCR öncesi uygulamalar için kullanılmalı ve bir master mix hazırlama alanı ve bir numune hazırlama alanı olarak bölünmelidir. Aerosollerin içeri girmesini önlemek için hava basıncı bir miktar pozitif olmalıdır.

İkinci oda, nükleik asit amplifikasyonu için ayrılmış bir alana ve ürün analizi için başka bir alana sahip olmalıdır. Amplikon aerosollerinin odadan çıkmasını engellemek için hava basıncı bir miktar negatif olmalıdır.

İki odalı bir PCR laboratuvarı için yeterli alan ya da bütçe yoksa, PCR öncesi ve amplifikasyon ve analiz alanları aynı odaya kurulabilir, ancak birbirlerinden mümkün olduğunca uzak olduklarından emin olunmalıdır.

PCR öncesi aktivitelerin amplifikasyon ve analiz alanından farklı odalar veya ayrı tezgahlar olarak ayrılmış olması çok önemlidir çünkü hazırlama sırasında genellikle düşük miktarda nükleik asit numunesine ve amplifikasyondan sonra çok yüksek bir konsantrasyona sahip olunur. Bu, master mix ve numunelerin hazırlandığı aynı alanda PCR analiz edilirse amplikon kontaminasyonu nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar alınabileceği anlamına gelir.

Ayrıca laboratuvar kurulumunun tek yönlü bir iş akışını izlediğinden emin olunmalıdır. Amplifikasyon ve analiz alanlarında kullanılan hiçbir materyal veya reaktif, tam bir dekontaminasyon yapılmadan PCR öncesi alana asla alınmamalıdır. Bu, her alan için özel ekipmana (örneğin iki farklı pipet seti gibi) ihtiyacınız olacağı anlamına gelir. Bu tek yönlü iş akışı, laboratuvar personeli için de geçerli olmalıdır. Amplifikasyon ve analiz alanlarında çalışanların PCR öncesi alana geri dönmesi gerekirse amplikon aerosolleri ile kontamine olmuş olabileceğinden kişisel koruyucu ekipmanlar değiştirilmelidir.

Bir PCR laboratuvarı kurarken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önlem, mekansal ayırmaya ek olarak zamansal ayırmadır. Örneğin, PCR reaksiyonları sabah saatlerinde, amplifikasyon ve analiz adımları öğleden sonra gerçekleştirilebilir. Bu, esnekliği sınırlayabilir, ancak kontaminasyon sorunlarını ve test tekrarı zorunluluğunu ortadan kaldırır.
















 

3- PCR ekipmanı için ipuçları

PCR laboratuvarları genel olarak santrifüjler, vorteks karıştırıcılar, pipetler, buzdolapları ve dondurucular, termocycler (ısı döngüleyiciler) ve analiz cihazları (örneğin elektroforez sistemleri) gibi çeşitli ekipmanlara ihtiyaç duyar. PCR laboratuvarının boyutuna ve uygulamalarına bağlı olarak, ihtiyaç duyulacak ekipman miktarı değişebilir. Size bir “alışveriş listesi” vermek yerine, PCR reaksiyonlarınızın kontaminasyonunu minimum seviyede tutmak için ekipman ve sarf malzemeleri satın alırken nelere dikkat etmeniz gerektiğini özetleyeceğiz.

3.1- Laminer akış veya biyogüvenlik kabini

PCR öncesi alanda amplikon aerosolleri olmadığından asla %100 emin olunamayacağı için PCR reaksiyonları, işe başlamadan önce ve bitirdikten sonra bir çamaşır suyu solüsyonuyla dekontamine edilmiş bir laminer akış veya biyogüvenlik kabinine kurulmalıdır.
 

3.2- Pipet uçları ve diğer sarf malzemeleri

Normal pipet uçlarından daha pahalı olmasına rağmen PCR kurulumu için filtre uçlarının kullanılması aerosollerin pipete girmesini ve pipeti kontamine etmesini ve pipette zaten mevcut olabilecek aerosollerin master mixi veya numuneleri kirletmesini önleyecektir. Filtre ucu tüketimini en aza indirmek için önce tüm tüpler yalnızca bir uç veya uç seti kullanarak (çok kanallı pipetler kullanılıyorsa) master mixle doldurulabilir ve numune başına bir uç kullanarak örneklerle devam edilebilir. Numuneyi en son eklemek de önerilen bir uygulamadır çünkü numuneyi bir sıvıya aktarmak boş bir tüpe aktarmaktan daha kolaydır ve pipetlerken numuneyi aerosol haline getirme riskini azaltır. Aerosol oluşumunu önlemeye yardımcı olacak en iyi pipetleme uygulamalarını öğrenmek için bu blog yazısını okuyabilirsiniz.

Sarf malzemeleri için; PCR reaktifleri geldiğinde laboratuvarda yeterli sayıda vial bulunduğundan emin olunmalıdır. Bunları daha küçük kaplara bölmek, raf ömürlerini arttıracak ve çok fazla donma/çözülme döngüsünden geçmelerini önleyecektir. Reaktifler kontamine olursa ikinci bir PCR için temiz alikotlar mevcut olacağından tüm kaynağı çöpe atmaktan da kurtaracaktır.

Son olarak, tüm sarf malzemelerinin ve ekipmanın DNase, RNase ve PCR inhibitörleri içermediğinden emin olunması gerekir. Her zaman uç ve sarf malzemelerinde bu potansiyel kirleticilerden arınmış olduğunu sertifikalandırabilen üreticilerin steril ürünleri seçilmelidir.




















4- Temizlik ve kontaminasyon kontrolü

Laboratuvar kurulurken temizlik veya kontaminasyon kontrolü konusunda endişelenmeye gerek yoktur ancak laboratuvar hazır ve çalışır durumdayken temizlik ve kontaminasyon kontrolü çok önemlidir. Aşağıda bu konuya kısaca değinilecek.

PCR reaksiyonları ister bir çeker ocak altında ya da bir biyogüvenlik kabininde, isterse de açık bir tezgahta gerçekleştirilecek olsun, kurulumdan önce ve sonra çalışma alanının taze yapılmış bir çamaşır suyu solüsyonu ve damıtılmış su ile silinerek dekontamine edilmesi gerekecektir. Amplifikasyon ve analiz alanlarında da aynı işlem yapılmalıdır. Ayrıca pipetlerin, ekipmanların, kapı kollarının, buzdolabı ve derin dondurucuların kollarının da düzenli olarak temizlendiğinden emin olunmalıdır.

PCR testleri çok hassas olduğu için burada açıklanan tüm önleyici tedbirler yine de deneylerin asla kontamine olmayacağını garanti etmeyebilir. Bu nedenle, kontaminasyonu erken tespit etmek için uygun kontrollerin dahil edilmesi gereklidir. Master mix kontaminasyonlarını belirlemeye ve ekstraksiyon protokolünün, reaktiflerin ve amplifikasyon adımlarının performansını doğrulamaya yardımcı olacağından, her zaman negatif ve pozitif kontroller dahil edilmelidir. Ek olarak, laboratuvardaki pozitiflik oranı izlenmeli ve beklenmeyen artışların tespit edilmesinin, örneğin mevsimsel bir salgın gibi, tanımlanabilir nedenleri olduğundan emin olunmalıdır.


5- Sonuçlar

PCR laboratuvarınızı kurma konusunda hala aynı heyecanı yaşadığınızı ve bu blog yazısının bu kurulumu sizin için daha az göz korkutucu hale getirdiğini umuyoruz. Sonraki nükleik asit miktar tayini iş akışları için neye ihtiyacınız olacağını merak ediyorsanız, moleküler biyoloji laboratuvarı kurulum serimizin üçüncü bölümünü okuyabilirsiniz.

 
Kaynak: https://www.integra-biosciences.com/global/en/blog/article/setting-pcr-lab-scratch



 

Takip Et

Facebook
Twitter
LinkedIn
Instagram
YouTube

Paylaş

Facebook
Twitter
LinkedIn

Bunları da beğenebilirsiniz!

Kullanılmış Maskeler Mikroplastik Riski Oluşturuyor

Kullanılmış Maskeler Mikroplastik Riski Oluşturuyor

Bilim insanları, tek kullanımlık maskelerin çevre için önemli ölçüde mikroplastik riski oluşturabileceği konusunda uyarıyor ve atıkların bertarafı için gelişmiş stratejilere acil bir ihtiyaç olduğunu vurguluyor.
  • 19 Ağu 2021

Devamı...

Nükleik Asitler Nasıl Saflaştırılır

Nükleik Asitler Nasıl Saflaştırılır?

Yeni bir laboratuvar kurma sürecinde nükleik asit saflaştırma için neye ihtiyacınız olduğunu mu merak ediyorsunuz? Yoksa numunelerinizin aşağı akış uygulamanız için yeterince saf olmadığını mı fark ettiniz? Öyleyse doğru yerdesiniz. Bu makale, “Numunelerden Saf Nükleik Asitlere” serimizin dördüncü ve son bölümünü oluşturuyor. Nükleik asit ekstraksiyonu, bir PCR laboratuvarı kurulumu ve nükleik asit miktar tayini ve görselleştirme konularını ele aldıktan sonra, şimdi farklı saflaştırma yöntemlerinden bahsedeceğiz. Her tekni
  • 5 Ağu 2021

Devamı...

Nükleik Asitlerin Saflık ve Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Nükleik Asitlerin Saflık ve Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Nükleik asitlerin örneklerden saflaştırılması moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın bir iş akışıdır. Doğru kararları almanıza yardımcı olmak için bir laboratuvar kurarken ve ekipman satın alırken nelere dikkat etmeniz gerektiğini açıklayan dört bölümlük bir dizi hazırladık. Nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerini ve bir PCR laboratuvarının nasıl kurulduğunu anlattıktan sonra, şimdi nükleik asitlerin konsantrasyonunu, verimini ve saflığını belirlemek için farklı yöntemlere göz atacağız.
  • 27 Tem 2021

Devamı...

Nükleik Asit Ekstraksiyonu İçin Gerekli Ekipmanlar Nelerdir

Nükleik Asit Ekstraksiyonu İçin Gerekli Ekipmanlar Nelerdir?

Nükleik asit ekstraksiyonu (NAE), birçok moleküler biyoloji uygulamasının ilk adımıdır ve bu nedenle bir laboratuvar kurarken cevaplanması gereken ilk sorulardan biri ne tür bir ekipmana ihtiyaç olduğudur. INTEGRA kendisi için yakın zamanda bir laboratuvar kurarken farklı seçenekleri değerlendirdi ve süreci kısaltmaya yardımcı olmak için bu değerlendirmeleri bir araya getirdi. Bu blog yazısı, bir moleküler biyoloji laboratuvarının sıfırdan nasıl kurulacağına dair bir araya getirilen dört makalelik bir dizinin ilk bölümüdür.
  • 6 Tem 2021

Devamı...

Hiçbir Paylaşımı Kaçırmayın



İletişim Formu

Son paylaşımlar

Kullanılmış Maskeler Mikroplastik Riski Oluşturuyor

Kullanılmış Maskeler Mikroplastik Riski Oluşturuyor

Nükleik Asitler Nasıl Saflaştırılır

Nükleik Asitler Nasıl Saflaştırılır?

Nükleik Asitlerin Saflık ve Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Nükleik Asitlerin Saflık ve Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Bir PCR Laboratuvarı Nasıl Kurulur

Bir PCR Laboratuvarı Nasıl Kurulur?

Nükleik Asit Ekstraksiyonu İçin Gerekli Ekipmanlar Nelerdir

Nükleik Asit Ekstraksiyonu İçin Gerekli Ekipmanlar Nelerdir?

Protein Aktivitesinin Glikozilasyon Yoluyla Modifikasyonunun COVID19un Şiddetini Tahmin Etmek için Kullanılması

Protein Aktivitesinin Glikozilasyon Yoluyla Modifikasyonunun COVID-19’un Şiddetini Tahmin Etmek için Kullanılması

Biyofarmasötikler Nasıl Üretilir

Biyofarmasötikler Nasıl Üretilir?

Hücre Kültürü Çalışmalarında Saf Suyun Önemi Nedir

Hücre Kültürü Çalışmalarında Saf Suyun Önemi Nedir?

Doğal Bileşiklerin Saflaştırılması İçin Tavsiyeler

Doğal Bileşiklerin Saflaştırılması İçin Tavsiyeler

Antibiyotik Direncine Karşı Mücadelede Otomatik Pipetleme Robotlarının Kullanımı

Antibiyotik Direncine Karşı Mücadelede Otomatik Pipetleme Robotlarının Kullanımı

Covid19 Tanı Testlerinde Hücre Parçalanmasının Rolü

Covid-19 Tanı Testlerinde Hücre Parçalanmasının Rolü

ICPMS ve ICPOES analizlerinde saf suyun önemi nedir

ICP-MS ve ICP-OES analizlerinde saf suyun önemi nedir?

Flash kromatografi sistemlerinin bakımı nasıl yapılır

Flash kromatografi sistemlerinin bakımı nasıl yapılır?

Elektronik Pipetlerin Mikrobiyal Evrim Araştırmalarında Tarama için Kullanılması

Elektronik Pipetlerin Mikrobiyal Evrim Araştırmalarında Tarama için Kullanılması

Nanoemülsiyonlar CBD Yağını İçeceklere Karıştırmak

Nanoemülsiyonlar: CBD Yağını İçeceklere Karıştırmak

Laboratuvar için Farklı Saf Su Tipleri Hakkında Bilmeniz Gerekenler

Laboratuvar için Farklı Saf Su Tipleri Hakkında Bilmeniz Gerekenler

2021 için Kromatografi ve Rotary Evaporasyona Yönelik Kristal Küre Tahminleri

2021 için Kromatografi ve Rotary Evaporasyona Yönelik Kristal Küre Tahminleri

INTEGRA VOYAGER Aralıkları Ayarlanabilir Elektronik Pipetler Yardımıyla Yeni Nesil Bilim İnsanlarını Eğitmek

INTEGRA VOYAGER Aralıkları Ayarlanabilir Elektronik Pipetler Yardımıyla Yeni Nesil Bilim İnsanlarını Eğitmek

CBD Yağı Bazlı Nanoemülsiyonlar Üretmek için Kullanılan Yöntemler

CBD Yağı Bazlı Nanoemülsiyonlar Üretmek için Kullanılan Yöntemler

Hepatit B Enfeksiyonunu Önlemek için DNA Aşılarının Araştırılması

Hepatit B Enfeksiyonunu Önlemek için DNA Aşılarının Araştırılması

Gelin bu olağandışı yılı sıra dışı bir blog yazısıyla noktalayalım

Gelin bu olağandışı yılı sıra dışı bir blog yazısıyla noktalayalım!

Doğru Rezervuar ile Değerli Reaktiflerinizi Koruyun ve Tasarruf Edin

Doğru Rezervuar ile Değerli Reaktiflerinizi Koruyun ve Tasarruf Edin

Tanı Testleri için Kaliteli Enzimler Nasıl Oluşturulur

Tanı Testleri için Kaliteli Enzimler Nasıl Oluşturulur?

Papatya Çayındaki Ağır Metallerin Tespit Edilmesi

Papatya Çayındaki Ağır Metallerin Tespit Edilmesi

INTEGRA çözümleri tanı test ve araştırmalarını nasıl hızlandırıyor

INTEGRA çözümleri tanı test ve araştırmalarını nasıl hızlandırıyor?

Kararlı ve steril Propofol nasıl üretilir

Kararlı ve steril Propofol nasıl üretilir?

Kromatografi kolonları kuru doldurma dry packing yöntemiyle üç adımda nasıl doldurulur

Kromatografi kolonları kuru doldurma (dry packing) yöntemiyle üç adımda nasıl doldurulur?

Gıda Ambalajları için Yeşil Plastiklerin Geliştirilmesi

Gıda Ambalajları için Yeşil Plastiklerin Geliştirilmesi

VOYAGER Aralıkları Ayarlanabilir Elektronik Pipet Basel Üniversitesinde immünoloji araştırmalarını nasıl hızlandırıyor

VOYAGER Aralıkları Ayarlanabilir Elektronik Pipet Basel Üniversitesi'nde immünoloji araştırmalarını nasıl hızlandırıyor?

Hücre parçalanması nedir ve bunun için hangi metotlar kullanılır

Hücre parçalanması nedir ve bunun için hangi metotlar kullanılır?

RFID teknolojisi kromatografi analizlerine nasıl yardımcı olur

RFID teknolojisi kromatografi analizlerine nasıl yardımcı olur?

Biyomimikri ArGeye Giden Doğal Yol

Biyomimikri: Ar-Ge'ye Giden Doğal Yol

Elektronik Pipet Kullanmak için 5 Neden

Elektronik Pipet Kullanmak için 5 Neden

Aşı Geliştirme Çalışmalarında Microfluidizer Teknolojisi Nasıl Kullanılır

Aşı Geliştirme Çalışmalarında Microfluidizer Teknolojisi Nasıl Kullanılır?

Kromatografi analizlerinde pik bölünmesi ve pik omuzlanması nasıl önlenir

Kromatografi analizlerinde pik bölünmesi ve pik omuzlanması nasıl önlenir?

Virüslerin Saptanması ve Karakterizasyonunda HPLCnin Rolü Nedir

Virüslerin Saptanması ve Karakterizasyonunda HPLC'nin Rolü Nedir?

Kozmetik ürünlerin etiketlerindeki maddeler nasıl elde edilir

Kozmetik ürünlerin etiketlerindeki maddeler nasıl elde edilir?

Aşı Taşıyıcı Sistemlerin Tasarımında Lipid Nanopartiküllerin Kullanımı

Aşı Taşıyıcı Sistemlerin Tasarımında Lipid Nanopartiküllerin Kullanımı

Microfluidizer İşlemcileri Aşı Üretimine Destek İçin Nasıl Kullanılır

Microfluidizer İşlemcileri Aşı Üretimine Destek İçin Nasıl Kullanılır?

COVID19 için PCR işlemlerinizi hızlandırın

COVID-19 için PCR işlemlerinizi hızlandırın

Kahvenizin içinde ne var

Kahvenizin içinde ne var?

Etiketler

PCR   qPCR   RT-PCR   Mikrobiyoloji   Laboratuvar   

Pipet   Pipetleme   Integra   

Makaledeki ürünler

EVOLVE Manuel Pipet

EVOLVE Manuel Pipet

VIAFLO ASSIST Otomotik Pipetleme Platformu

VIAFLO ASSIST Otomotik Pipetleme Platformu

GRIPTIPS Pipet Uçları

GRIPTIPS Pipet Uçları

REAKTİF HAZNESİ 96  384 Polipropilen Reaktif Hazneleri

REAKTİF HAZNESİ 96 / 384 Polipropilen Reaktif Hazneleri

VIAFLO ASSIST PLUS Pipetleme Robotu

VIAFLO ASSIST PLUS Pipetleme Robotu

MINI 96 96 Kanallı Taşınabilir Elektronik Pipet

MINI 96 96 Kanallı Taşınabilir Elektronik Pipet