FAMEs Analizi için Mikrodalga Destekli Numune Hazırlamanın AOCS Protokollerine Karşı Doğrulanması

Yağ Asidi Metil Esteri (FAME) analizi, hem gıda hem de yem endüstrilerinde ve ilgili üçüncü taraf kalite kontrol laboratuvarlarında, doymuş, tekli doymamış ve çoklu doymamış yağ içeriklerini hesaplamak için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu laboratuvarların büyük bir kısmı, genellikle tehlikeli reaktiflerin kullanıldığı, standart ve artık güncelliğini yitirmiş yöntemlere dayanan çeşitli AOCS metotlarını takip etmektedir.

Milestone’un ETHOS X mikrodalga destekli teknolojisine dayalı FAME protokolleri, geleneksel tekniklere güçlü bir alternatif sunmaktadır.

Bu çalışma, söz konusu mikrodalga destekli yöntemin güvenilirliğini, geleneksel AOCS prosedürlerine karşı kanıtlamayı amaçlamaktadır.

Giriş

ABD ve AB’de, gıdalarda yağ tayini, doğru etiketleme ve kalite kontrolü sağlamak amacıyla düzenleyici standartlara tabidir. ABD’de FDA ve USDA, gıda türüne göre yöntemleri (örneğin toplam yağ ekstraksiyonu) belirleyerek yağ analizi mevzuatından sorumlu kuruluşlardır. Benzer şekilde AB’de, EFSA gözetiminde 1169/2011 sayılı AB Yönetmeliği kapsamında standartlaştırılmış protokoller uygulanmaktadır.

Yağın karakterizasyonu için en yaygın kullanılan tekniklerden biri, yağın yağ asidi metil esterlerine (FAMEs) dönüştürülmesidir. Bu yöntem, gaz kromatografisi (GC) aracılığıyla yağ asidi bileşiminin ayrıntılı profilini elde etmeyi sağlar. AOCS metotlarının (AOCS Ce 2b-11 ve 2c-11) konusu olan bu süreç, lipid ekstraksiyonunu takiben transesterifikasyon ile FAME’lerin oluşumunu içerir ve tek tek yağ asitlerinin doğru ölçümüne imkân verir.

Yöntemin doğruluğuna rağmen, geleneksel FAME analiz yöntemleri uzun ve çözücü yoğun adımlar içerir; bu da verimliliği düşük ve çevre açısından olumsuz hale getirir. Son yıllarda, bu geleneksel yönteme alternatif olarak mikrodalga destekli ekstraksiyon (MAE) dikkat çekmiştir. MAE, lipid ekstraksiyonunu ve transesterifikasyonu hızlandırmak için mikrodalga enerjisi uygular; böylece hem çözücü kullanımını hem de ekstraksiyon süresini azaltır. Bu tekniğin, standart yöntemlerle karşılaştırılabilir veya daha yüksek doğruluk sağladığı, ayrıca işletme maliyetlerini düşürdüğü gösterilmiştir.

Bu raporda sunulan çalışmanın amacı, farklı gıda matrislerinde FAME profili elde etmenin farklı yollarını karşılaştırmaktır. Özellikle, iki AOCS yöntemini (bazik ve asidik koşullar altında FAME hazırlığı) hem hidrolizli hem de hidrolizsiz yağ ekstraksiyonu üzerinde yapılan MAE türevlendirmesiyle ve yenilikçi tek aşamalı MAED tekniği ile karşılaştırdık.

Genel olarak, altı farklı gıda matrisi üzerinde yedi farklı yöntem değerlendirilmiş ve ardından ortak bir yöntemle GC (GC x GC)-FID analizi yapılmıştır.

Deney

Ekipmanlar

• Milestone ETHOS X 

• SR-15 easyTEMP ekstraksiyon rotoru

• Alüminyum kapaklar

• SFS-24 filtrasyon sistemi

• Yoğuşma modüllü vakum sistemi

• Analitik terazi (doğrudan terminale arayüz ile bağlantılı)

• Geleneksel yöntemlerde ise, ilgili cam malzemelerle birlikte Soxhlet ekstraksiyon düzeneği kullanılmıştır.

Şekil 1 – Milestone’un SR-15 ekstraksiyon rotoru ve RAR-15 buharlaştırma rotoruna sahip ETHOS X modeli.

Solventler ve Reaktifler

Çözücüler ve reaktifler Merck KGaA (Almanya) firmasından temin edilmiştir.

Kullanılan kimyasallar şunlardır:

• %25 sülfürik asit çözeltisi

• %14 bor triflorür (BF₃) çözeltisi (metanol içinde)

• Asidik metanol (1.25 M HCl)

• ACS reaktif saflık derecesinde siklohekzan, pentan, hekzan, petrol eteri, metanol

• Susuz sodyum sülfat

• Sodyum hidroksit

Numuneler

Bu çalışma için, sertifikalı referans malzemeler ve marketten satın alınan etiketli gıdalar kullanılmıştır.

Kullanılan referans malzemeler:

• Cordon-bleu (RCIL n° 2022-2023-0544)

• Fabrika yapımı hamur işi (RCIL n° 2022-2023-0446)

Bu referanslar, FAME referans profilinin sertifikalı değerine sahip oldukları için BIPEA tarafından sağlanmıştır.

Kullanılan ticari gıdalar arasında şunlar yer almaktadır:

• Sürülebilir krema

• Bebek maması formülleri

• Peynir (gouda)

• Yulaf gevreği

Ticari gıda numuneleri, temsil edici bir örnek alınabilmesi için tartım adımından önce homojenize edilmelidir. Numuneler herhangi bir kurutma işlemi uygulanmadan, doğrudan kullanılmıştır.

Ekstraksiyon için Prosedürler

MAHE – Mikrodalga Destekli Hidroliz Ekstraksiyonu

Yaklaşık 3 g numune, doğrudan SR-15 eT ekstraksiyon kaplarına tartılmıştır. Daha sonra, 10 mL sülfürik asit (%25) ve 25 mL siklohekzan eklenmiş, son kütle kaydedilmiştir.

Her kaba manyetik karıştırıcı çubukları eklenmiştir. SR-15 eT düzgün şekilde monte edilmiştir.

Mikrodalga programı Tablo 1’de verilmiştir.

Adım	Süre (dk:ss)	Sıcaklık (°C)	Güç (W)	Karıştırıcı
1	00:03:00	90 °C	1400 W	%80
2	00:04:00	135 °C	1400 W	%80
3	00:40:00	135 °C	1400 W	%80

Tablo 1 – ETHOS X MAEH programı

Programın sonunda SR-15 eT kapları açılmış ve organik fazdan alınan alikotlar alüminyum kaplara aktarılıp tartılmıştır.

Daha sonra, RAR-15 buharlaştırma rotoru kullanılarak hızlı çözücü buharlaştırma işlemi yapılmış ve alüminyum kaplar toplam yağ tayini için yeniden tartılmıştır.

FAME hazırlığı, çıkarılan kalıntının 100 mg’lık bir alikotu üzerinde sırasıyla gerçekleştirilmiştir:

• Resmî türevlendirme prosedürü AOCS Ce 2b-11 (MAEH-BF₃)

• Asidik koşullarda mikrodalga kullanılarak yapılan türevlendirme (MAEH-HCl/MeOH)

MAE – Mikrodalga Destekli Çözücü Ekstraksiyonu

Yaklaşık 3 g numune, doğrudan SR-15 eT ekstraksiyon kaplarına tartılmıştır. Daha sonra 30 mL pentan eklenmiştir.

Her kaba manyetik karıştırıcı çubukları yerleştirilmiş ve SR-15 eT düzgün şekilde kapatılmıştır.

Mikrodalga programı Tablo 2’de verilmiştir.

Adım	Süre (dk:ss)	Sıcaklık (°C)	Güç (W)	Karıştırıcı
1	00:10:00	120 °C	1400 W	%80
2	00:40:00	120 °C	1400 W	%80

Tablo 2 – ETHOS X MASE programı

Programın sonunda SR-15 eT kapları açılmıştır. Çözelti, 0.45 μm PTFE filtreler üzerinden, sodyum sülfat filtreleme ajanı olarak kullanılarak Milestone SFS-24 sistemine süzülmüştür.

Filtrelenmiş çözeltiler daha sonra RAR-15 cihazına aktarılmış ve hızlı buharlaştırma yapılmıştır.

Son olarak, alüminyum kaplarda kalan artık tartılmış ve serbest yağ miktarı belirlenmiştir.

FAME hazırlığı, ekstrakte edilen kalıntının 100 mg’lık bir alikotu üzerinde sırasıyla gerçekleştirilmiştir:

• Resmî türevlendirme prosedürü AOCS Ce 2b-11 (MASE-BF₃)

• Asidik koşullarda mikrodalga kullanılarak yapılan türevlendirme (MASE-HCl/MeOH)

Türevlendirme için Prosedürler

Resmî Türevlendirme Prosedürleri

Bu çalışmada AOCS Ce 2b-11 ve AOCS Ce 2c-11 ile tanımlanan iki resmî yöntem test edilmiştir.

Resmî Yöntem Ce 2b-11

• Bu yöntem, gıdadan alkalin koşullarda doğrudan metilasyon esasına dayanır.

• Numune, yöntem tablosuna göre tartılmıştır.

• 5 mL NaOH/MeOH (0.5 M) eklenmiş ve 15 dakika reflüks altında tutulmuştur.

• Ardından, %14 BF₃ çözeltisi (MeOH içinde) 5 mL eklenmiş ve 2 dakika daha reflüks edilmiştir.

• Son aşamada 5 mL hekzan eklenmiş, ısıtma olmaksızın karıştırmaya bırakılmıştır.

• Soğutmanın ardından, FAME’leri içeren süpernatanttan alikot alınmış ve GC analizine (çift örnekli) gönderilmiştir.

Resmî Yöntem Ce 2c-11

• Bu yöntem, gıdadan alkali-asidik koşullarda doğrudan metilasyon esasına dayanır.

• Numune, yöntem tablosuna göre tartılmıştır.

• 5 mL asidik metanol çözeltisi (1.25 M) eklenmiş ve 15 dakika reflüks altında tutulmuştur.

• Ardından 5 mL NaOH/MeOH (2.3 M) eklenmiş ve 15 dakika daha reflüks edilmiştir.

• Daha sonra, %14 BF₃ çözeltisi (MeOH içinde) 10 mL eklenmiş ve 2 dakika reflüks edilmiştir.

• Son aşamada 5 mL hekzan eklenmiş, ısıtma olmaksızın karıştırmaya bırakılmıştır.

• Soğutmanın ardından, FAME’leri içeren süpernatanttan alikot alınmış ve GC analizine (çift örnekli) gönderilmiştir.

MAED – Mikrodalga Destekli Ekstraksiyon ve Türevlendirme

Bu yenilikçi prosedür, mikrodalga ısıtmasının avantajını kullanarak ekstraksiyon ve türevlendirmeyi doğrudan numuneden başlatarak birleştirir.

• 500 mg numune, doğrudan SR-15 eT ekstraksiyon kaplarına tartılmıştır.

• Ardından, 10 mL HCl’li metanol çözeltisi (1.25 M) ve 25 mL siklohekzan eklenmiştir.

• Her kaba manyetik karıştırıcı çubukları eklenmiş ve SR-15 eT düzgün şekilde kapatılmıştır.

Mikrodalga programı Tablo 3’te verilmiştir.

Adım	Süre (dk:ss)	Sıcaklık (°C)	Güç (W)	Karıştırıcı
1	00:02:00	120 °C	1400 W	%80
2	00:15:00	120 °C	1400 W	%80

Tablo 3 – ETHOS X MAED programı

Programın sonunda SR-15 eT kapları açılmış, soğutmanın ardından FAME içeren süpernatanttan alikot alınmış ve çift örnekli olarak GC analizine gönderilmiştir.

Analitik Kondisyonlar

Bu çalışmada, split/splitless enjektör, otokarşılaştırıcı (autosampler) ve FID dedektör ile donatılmış bir GC (GC x GC) kullanılmıştır.

• Numune enjeksiyon hacmi: 1 μL

• Kullanılan kolonlar:

  • Birinci boyut için: SepSolve 1D-FAME (20 m × 0.18 mm × 0.1 μm)

  • İkinci boyut için: SepSolve 2D-FAME (5 m × 0.25 mm × 0.1 μm)

• Dedektör sıcaklığı: 250 °C

• İki aşamalı rampa fırın programı kullanılmıştır.

Isınma Hızı (°C/dk)	Sıcaklık (°C)	Bekleme Süresi (dk)
10	40	2
11	250	2

Tablo 4 – GC fırın programı

Helyum taşıyıcı gaz olarak kullanıldı.

Sonuçlar ve Tartışma

Bu çalışmada amacımız, FAME’lerin numune hazırlama adımlarındaki — yağ ekstraksiyonu ve türevlendirme — süreçlerde mikrodalga teknolojisinin katkısını açıklığa kavuşturmaktır.

Yağ ekstraksiyonu zorunlu bir adım değildir; ancak kontrol laboratuvarlarında belirlenmesi gereken temel bir parametredir. Bu nedenle, bu tür laboratuvarlar için hem yağ tayini hem de yağ asidi profilinin türevlendirme ve GC analiziyle yapılabilmesini sağlayan bir numune hazırlama cihazının kullanılması oldukça faydalıdır.

Yağ ekstraksiyonu iki şekilde yapılabilir:

• Hidroliz ile (MAEH) → Toplam Yağ parametresine işaret eder.

• Yalnızca çözücü ekstraksiyonu ile (MASE) → Serbest veya Ham Yağ parametresine işaret eder.

Bu doğrultuda, seçilen altı farklı matris hem tek aşamalı doğrudan türevlendirme (AOCS yöntemleri ve MAED) hem de ön ekstraksiyon içeren iki aşamalı prosedürle test edilmiştir.

Ardından FAME’ler, farklı FAME türlerini ayırt etmeye yardımcı olan 2 boyutlu GC ile değerlendirilmiştir. Burada FID dedektör kullanılmıştır. Tüm GC grafiklerinin entegrasyonu yapılmış ve FAME profilleri hesaplanmıştır. Bu hesaplamalarda doymuş (SFA), tekli doymamış (MUFA) ve çoklu doymamış (PUFA) yağların toplamları dikkate alınmıştır.

Tek Aşamalı Yöntemlerin Karşılaştırılması

Aşağıdaki tablolar ve grafikler, FAME elde etmek için kullanılan tek aşamalı prosedürleri karşılaştırmaktadır:

• İki AOCS yöntemi

• MAED mikrodalga yöntemi

(SFA – Doymuş Yağ Asitleri %)

Numune	Referans Değeri (%)	AOCS Ce 2c-11 (%)	AOCS Ce 2b-11 (%)	MAED (%)
Cordon Bleu	23.6 ± 0.2	23.5 ± 0.2	23.2 ± 0.1	23.8 ± 0.1
Hamur işi	15.1 ± 0.2	16.0 ± 0.02	15.4 ± 0.1	17.4 ± 0.2
Peynir	–	66.5 ± 0.01	66.9 ± 0.01	66.3 ± 0.01
Bebek maması	–	18.7 ± 0.2	19.0 ± 0.2	19.4 ± 0.03
Sürülebilir krema	–	19.7 ± 0.03	22.3 ± 2.8	19.6 ± 0.03
Yulaf	–	19.3 ± 0.3	17.0 ± 1.3	22.8 ± 0.1

(MUFA – Tekli Doymamış Yağ Asitleri %)

Numune	Referans Değeri (%)	AOCS Ce 2c-11 (%)	AOCS Ce 2b-11 (%)	MAED (%)
Cordon Bleu	44.1 ± 0.2	45.3 ± 0.02	44.8 ± 0.2	44.1 ± 0.6
Hamur işi	60.4 ± 0.4	60.0 ± 0.2	60.1 ± 0.1	59.9 ± 1.6
Peynir	–	30.5 ± 0.1	30.2 ± 0.04	30.7 ± 0.1
Bebek maması	–	63.9 ± 0.2	63.4 ± 0.2	62.9 ± 0.1
Sürülebilir krema	–	63.3 ± 0.1	66.7 ± 3.8	62.5 ± 0.02
Yulaf	–	39.2 ± 0.4	35.8 ± 2.9	34.9 ± 0.2

(PUFA – Çoklu Doymamış Yağ Asitleri %)

Numune	Referans Değeri (%)	AOCS Ce 2c-11 (%)	AOCS Ce 2b-11 (%)	MAED (%)
Cordon Bleu	32.0 ± 0.1	31.2 ± 0.2	32.0 ± 0.2	32.1 ± 0.6
Hamur işi	24.4 ± 0.4	23.9 ± 0.2	24.5 ± 0.002	22.8 ± 1.5
Peynir	–	2.9 ± 0.1	2.9 ± 0.05	3.0 ± 0.002
Bebek maması	–	17.4 ± 0.02	17.7 ± 0.01	17.8 ± 0.1
Sürülebilir krema	–	17.1 ± 0.03	18.0 ± 7.8	17.9 ± 0.003
Yulaf	–	41.5 ± 0.1	47.2 ± 4.2	42.4 ± 0.1

Tablo 5–7 – Tek Aşamalı Yöntemlerdeki Sonuçlar Altı farklı matriste doymuş (SFA), tekli doymamış (MUFA) ve çoklu doymamış (PUFA) yağların toplamları, tek aşamalı yöntemler için hesaplanmış ve tablolar hâlinde sunulmuştur.

Şekil 2-7 – Değerlendirilen üç tek aşamalı yöntemin yağ asitleri toplamının karşılaştırma histogramları

İki Aşamalı Yöntemlerin Karşılaştırılması

Yağ tayinini gerçekleştirmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntem vardır:

1. Basit çözücü ekstraksiyonu

2. Hidroliz (genellikle sülfürik asit ile) sonrasında çözücü ekstraksiyonu

Her iki yöntem de mikrodalga kullanılarak verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Buna ek olarak, türevlendirme için iki farklı yaklaşım incelenmiştir:

• Birincisi, Soxhlet sistemi kullanılarak ve BF₃ katalizörü ile yapılmıştır.

• İkincisi ise, mikrodalga kullanılarak asidik metanol (HCl/MeOH) ile yapılmış olup, daha az tehlikeli bir türevlendirme ajanı kullanılmıştır.

SFA (Doymuş Yağ Asitleri %)

Numune	Referans Değeri (%)	MAEH-HCl/MeOH (%)	MAEH-BF₃ (%)	MASE-HCl/MeOH (%)	MASE-BF₃ (%)
Cordon Bleu	23.6 ± 0.2	23.5 ± 0.2	22.5 ± 0.1	22.5 ± 0.2	22.5 ± 0.3
Hamur işi	15.1 ± 0.2	16.1 ± 0.1	15.6 ± 0.01	14.8 ± 0.1	14.1 ± 0.2
Peynir	–	66.5 ± 0.5	65.6 ± 0.2	66.1 ± 0.05	67.5 ± 0.5
Bebek maması	–	19.4 ± 0.2	18.7 ± 0.02	17.7 ± 0.1	17.3 ± 0.1
Sürülebilir krema	–	19.0 ± 0.2	19.1 ± 0.05	19.5 ± 0.1	19.0 ± 0.2
Yulaf	–	21.6 ± 0.02	20.6 ± 0.2	18.7 ± 0.2	18.5 ± 0.2

MUFA (Tekli Doymamış Yağ Asitleri %)

Numune	Referans Değeri (%)	MAEH-HCl/MeOH (%)	MAEH-BF₃ (%)	MASE-HCl/MeOH (%)	MASE-BF₃ (%)
Cordon Bleu	44.1 ± 0.1	45.3 ± 0.02	44.8 ± 0.1	44.2 ± 0.1	44.9 ± 0.1
Hamur işi	60.4 ± 0.4	59.4 ± 0.03	59.8 ± 0.04	60.9 ± 0.04	61.3 ± 0.5
Peynir	–	30.4 ± 0.5	31.5 ± 0.2	31.0 ± 0.1	30.1 ± 0.5
Bebek maması	–	63.0 ± 0.1	63.3 ± 0.03	64.4 ± 0.05	64.3 ± 0.1
Sürülebilir krema	–	63.0 ± 0.3	62.8 ± 0.1	62.6 ± 0.01	62.8 ± 0.02
Yulaf	–	37.2 ± 0.2	37.9 ± 0.1	39.9 ± 0.1	41.0 ± 0.3

PUFA (Çoklu Doymamış Yağ Asitleri %)

Numune	Referans Değeri (%)	MAEH-HCl/MeOH (%)	MAEH-BF₃ (%)	MASE-HCl/MeOH (%)	MASE-BF₃ (%)
Cordon Bleu	23.6 ± 0.2	23.5 ± 0.2	22.5 ± 0.1	22.5 ± 0.2	22.5 ± 0.3
Hamur işi	15.1 ± 0.2	16.1 ± 0.1	15.6 ± 0.01	14.8 ± 0.1	14.1 ± 0.2
Peynir	–	3.1 ± 0.01	3.0 ± 0.01	2.9 ± 0.02	2.8 ± 0.02
Bebek maması	–	17.7 ± 0.1	18.0 ± 0.01	18.1 ± 0.1	18.4 ± 0.2
Sürülebilir krema	–	18.0 ± 0.1	18.2 ± 0.1	17.9 ± 0.1	18.2 ± 0.2
Yulaf	–	41.2 ± 0.2	41.5 ± 0.05	41.4 ± 0.2	40.5 ± 0.6

Tablo 8–10 – İki Aşamalı Yöntemler Sonuçları Altı farklı matriste doymuş (SFA), tekli doymamış (MUFA) ve çoklu doymamış (PUFA) yağların toplam değerleri, iki aşamalı yöntemler için hesaplanmış ve tablolar halinde sunulmuştur.

* Bu belirlemeler için ekstraksiyonun maksimum sıcaklığı 100 °C idi.

Şekil 8-13 – Değerlendirilen dört iki aşamalı yöntemin yağ asitleri toplamının karşılaştırma histogramları

Sonuç

Tek aşamalı yöntemler (MAED) için elde edilen sonuçlar, geleneksel AOCS yöntemleri ile mükemmel bir uyum göstermiştir. Referans materyallerde mikrodalga ile elde edilen veriler, BIPEA sertifikalarında bildirilen referans değerleriyle de tutarlı bulunmuştur.

İki aşamalı yöntemler (MASE ve MAEH) ile farklı türevlendirme koşullarının (BF₃ ve HCl/MeOH) karşılaştırılması, her iki mikrodalga yaklaşımının da aynı sonucu verdiğini ortaya koymuştur. Bu da HCl/MeOH türevlendirme yönteminin, operatör için tehlikeli ve laboratuvar için daha maliyetli olan BF₃ türevlendirmesine uygulanabilir bir alternatif olduğunu göstermektedir.

Genel olarak, ETHOS X kullanılarak hem tek aşamalı (MAED) hem de iki aşamalı (MASE ve MAEH) yöntemlerle elde edilen sonuçlar, geleneksel AOCS yöntemleri ile uyumlu, güvenilir ve doğru sonuçlar sağlamaktadır. Ancak ETHOS X, operatör için daha güvenli, analiz süresini daha kısa ve reaktif tüketimini daha düşük maliyetli hale getirmektedir.

ETHOS X’in ayrıca önemli bir esneklik avantajı vardır:

• Eğer laboratuvarın rutin olarak toplam yağ veya serbest yağ tayini yapması gerekiyorsa, ekstrakte edilen yağın bir kısmı alınarak çevre dostu HCl/MeOH türevlendirmesi ile iki aşamalı bir yaklaşım uygulanabilir.

• Eğer laboratuvar doğrudan yağ asidi profiline ulaşmak istiyorsa, tek aşamalı MAED yaklaşımı tercih edilmelidir.

Sonuç olarak, ETHOS X mikrodalga yaklaşımı, çok çeşitli gıda matrislerinde FAME tayini için doğru, güvenilir, güvenli ve ekonomik bir yöntem olduğunu kanıtlamaktadır.

Kaynak: Milestone SRL