Gıda Örneklerinden PAH’ların Mikrodalga Destekli Ekstraksiyonu

Polisiklik Aromatik Hidrokarbonlar (PAH’lar) insan sağlığı açısından tehlikeli moleküllerdir ve birçok ülkenin gıda örneklerinde bu bileşiklerin analizini zorunlu kılan yasal düzenlemeleri bulunmaktadır.

Mikrodalga destekli çözücü ekstraksiyonu, çeşitli resmi metotlarda kullanılan ve güvenilirliği kanıtlanmış bir numune hazırlama tekniğidir.

Bu çalışmada, Milestone ETHOS X sistemi ve fastEX-24 rotor eT kullanılarak, gıda matrislerinden PAH ekstraksiyonunda yöntemin etkinliği ortaya konmuştur.

Giriş

Polisiklik Aromatik Hidrokarbonlar (PAH’lar), karbon bazlı materyallerin yanması sonucu oluşan kirletici bir gruptur. Gıdalara hem çevresel faktörlerle hem de işleme sırasında bulaşabilirler. Özellikle tütsüleme, kurutma, kavurma ve barbekü gibi işlemler PAH seviyelerinin artmasına neden olur.

PAH’lar yüksek oranda lipid çözünürlüğüne sahip olduklarından memelilerin gastrointestinal sisteminden kolaylıkla emilirler. Çoğu toksik, mutajenik ve/veya kanserojen özellik taşır.

ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) ve Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA), 16 öncelikli PAH bileşiğini kirletici olarak tanımlamış olup bunlardan 8’i olası karsinojen olarak değerlendirilmektedir.

📌 EN 16619:2015 standardı, gıda örneklerinde bu 16 PAH içerisinden 4’ünün (benz[a]antrasen – BaA, benzo[a]piren – BaP, benzo[b]floranten – BbF ve krizene – CHR) tayinini tanımlar. Bu yöntem, diğer 12 öncelikli PAH’ın varlığında da söz konusu 4 bileşiğin gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile kantitatif analizine imkân verir.

Geleneksel olarak PAH ekstraksiyonu, basınçlı sıvı ekstraksiyonu (PLE) veya Soxhlet ekstraksiyonu ile yapılmaktadır.

Bu uygulama raporunda, Mikrodalga Destekli Ekstraksiyon yönteminin etkinliği test edilmiştir. Amaç, EN 16619:2015 standardı ile karşılaştırılabilir sonuçlara; ancak daha az çözücü kullanarak ve laboratuvar verimliliğini artırarak ulaşmaktır.

Deney

Ekipmanlar

• Milestone ETHOS X

• FastEX-24 eT rotor

• 100 mL tek kullanımlık cam vialler

• SFS-24 (Eşzamanlı Filtrasyon Sistemi)

Şekil 1 – Milestone’un fastEX-24 eT ve SFS-24 filtreleme sistemine sahip ETHOS X modeli.

Standartlar ve Reaktifler

• Standartlar, surrogatlar ve iç standartlar Sigma Aldrich’ten temin edilmiştir.

• Pestisit dereceli çözücüler kullanılmıştır.

• Susuz sodyum sülfat, silika jel (en az 16 saat boyunca 130 °C’de aktive edilmiş) ve cam yünü veya kağıt filtre temizleme prosedüründe kullanılmıştır.

• Analitik yöntem olarak EPA 8270e3 protokolüne göre iç standartlar ve surrogatlar uygulanmıştır.

Analit	CAS Numarası
Naphthalene-D8	1146-65-2
Acenaphthylene-D8	93951-97-4
Acenaphthene-D10	15067-26-2
Phenanthrene-D10	1517-22-2
Pyrene-D10	1718-52-1
Benzo[a]pyrene-D12	63466-71-7
Perylene-D12	1520-96-3

Tablo 1 – İç Standart Çözeltisi

Numuneler

PAH tayini için aşağıdaki referans örnekler kullanılmıştır:

• BIPEA laboratuvarlar arası örnekler (4 adet):

  • Biber

  • Rafine yağ

  • Kakao

  • Tütsülenmiş et

• IAEA sertifikalı materyal:

  • IAEA 451 – Dondurularak kurutulmuş biyota

Prosedürler

• Gıda örnekleri, standart prosedürler izlenerek hazırlanmıştır.

• Örnekler homojenize edilmiştir.

• Dondurarak kurutma (freeze drying), örneklerin işlenmesini kolaylaştırmıştır.

• Islak örnekler, ekstraksiyon öncesinde sodyum sülfat ile karıştırılmıştır.

• Örneğin bir kısmı doğrudan FastEX-24 eT rotorunun 100 mL tek kullanımlık cam viallerine tartılmış ve iç standart çözeltisi eklenmiştir.

• Üzerine 30 mL siklohekzan karışımı ilave edilmiş, ardından rotor kapatılmıştır (otomatik kapatma aparatı kullanılabilir).

Ekstraksiyon Süreci ve Temizleme

ETHOS X kütüphanesinde yer alan uygun dahili yöntem seçilerek işlem gerçekleştirilmiştir.

Adım	Süre (dk)	Güç (W)	Sıcaklık (°C)
1	15	1600’e kadar	110
2	20	1600’e kadar	110

Tablo 2 – Mikrodalga Programı

Şekil 2 – Mikrodalga çalışma profili

• Ekstraksiyonun ardından örnekler, susuz sodyum sülfat kullanılarak Milestone SFS-24 eşzamanlı filtrasyon sistemi ile filtrelenmiştir.

• Vialler ek çözücü alikotları ile durulanmıştır.

• SFS-24, farklı tip filtreler kullanılarak aynı anda 24 örneğin filtrelenmesine imkân tanır.

• Ekstraktlar ve durulama çözeltileri birleştirilmiştir.

• Elde edilen ekstraktlar, azot akışı ile yoğunlaştırılmış ve ardından GPC (Gel Permeation Chromatography) sistemi ile saflaştırılmıştır.

Analitik Kondisyonlar

• Cihaz: GC-MS (split/splitless enjektör, otomatik örnekleyici ve kütle dedektörü)

• Enjeksiyon hacmi: 1 µL

• Kolon: RXI-5MS kapiler kolon, 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm (Restek)

• Enjektör sıcaklığı: 290 °C

• Transfer hattı sıcaklığı: 300 °C

Isınma Hızı (°C/dk)	Sıcaklık (°C)	Bekleme Süresi (dk)
20	60	1.0
50	140	0.5
10	200	0.5
5	260	10.0
25	300	12.0

Tablo 3 – GC fırın programı

Helyum, yaklaşık 45 cm/s doğrusal hızda taşıyıcı gaz olarak kullanıldı.

Sonuçlar ve Tartışma

• Mikrodalga ekstraksiyonu ile elde edilen dört referans materyalin (Biber, Rafine Yağ, Kakao, Tütsülenmiş Et) PAH sonuçları Tablo 4, 5, 6 ve 7’de sunulmuştur.

• Elde edilen sonuçlar iyi bir uyum göstermektedir.

• Analitik geri kazanımın değerlendirmesi, analiz edilen tüm parametreler için tatmin edici bulunmuştur.

EN 16619:2015 standardı, gıda örneklerinde AB’nin öncelikli 16 PAH bileşiğinden 4’ünün tayini için bir yöntem tanımlar. Bu hedef PAH’lar:

• Benz[a]anthracene (BaA)

• Benzo[a]pyrene (BaP)

• Benzo[b]fluoranthene (BbF)

• Chrysene (CHR)

Bu dört bileşik, gıda değerlendirmeleri açısından en kritik analitlerdir. Ayrıca, bu dört PAH’ın toplamı da laboratuvar raporlarında belirtilmesi gereken anahtar bir parametredir.

Katılımcı laboratuvarların performansını değerlendirmek amacıyla, Yeterlilik Testi sağlayıcıları her bir sonuç için z-skoru hesaplar.

Formül:

​

• xi = laboratuvar sonucu

• X = atanmış değer

• σ = standart sapma

Yorumlama:

• |z| ≤ 2.0 → Tatmin edici (Satisfactory)

• 2.0 < |z| < 3.0 → Sorgulanabilir (Questionable, “uyarı sinyali”)

• |z| ≥ 3.0 → Tatmin edici değil (Unsatisfactory, “aksiyon sinyali”)

Analit	Atanmış Değer (µg/kg)	ETHOS X (µg/kg)	Z-skoru	Sonuç
Anthracene	3.3	4.1	0.94	✅ Tatmin edici
Benzo(a)anthracene (BaA)	2.9	3.3	0.53	✅ Tatmin edici
Benzo(a)pyrene (BaP)	3.1	2.6	-0.63	✅ Tatmin edici
Benzo(b)fluoranthene (BbF)	2.9	3.9	1.33	✅ Tatmin edici
Benzo(ghi)perylene	2.9	3.1	0.27	✅ Tatmin edici
Benzo(k)fluoranthene	3.6	4.0	0.44	✅ Tatmin edici
Chrysene (CHR)	4.1	3.7	-0.38	✅ Tatmin edici
TOPLAM (BaA, BaP, BbF, CHR)	13.6	13.5	-0.03	✅ Tatmin edici
Dibenzo(a,h)anthracene	3.2	2.9	-0.38	✅ Tatmin edici
Indeno(1,2,3-cd)pyrene	2.9	3.7	1.07	✅ Tatmin edici
Pyrene	7.3	7.0	-0.16	✅ Tatmin edici

Tablo 4 – Biber referans materyalinden elde edilen PAH sonuçları.

Analit	Atanmış Değer (µg/kg)	ETHOS X (µg/kg)	Z-skoru	Sonuç
Anthracene	1.9	2.3	0.80	✅ Tatmin edici
Benzo(a)anthracene (BaA)	1.8	2.4	1.33	✅ Tatmin edici
Benzo(a)pyrene (BaP)	1.9	2.6	1.40	✅ Tatmin edici
Benzo(b)fluoranthene (BbF)	1.7	2.3	1.33	✅ Tatmin edici
Benzo(ghi)perylene	1.7	2.3	1.33	✅ Tatmin edici
Benzo(k)fluoranthene	2.0	2.7	1.40	✅ Tatmin edici
Chrysene (CHR)	2.3	3.1	1.33	✅ Tatmin edici
TOPLAM (BaA, BaP, BbF, CHR)	7.4	10.5	1.68	✅ Tatmin edici
Dibenzo(a,e)pyrene	1.8	2.1	0.67	✅ Tatmin edici
Dibenzo(a,h)anthracene	2.3	3.1	1.33	✅ Tatmin edici
Dibenzo(a,h)pyrene	1.9	2.3	0.80	✅ Tatmin edici
Dibenzo(a,i)pyrene	1.7	1.0	-1.56	✅ Tatmin edici
Dibenzo(a,l)pyrene	2.0	2.7	1.40	✅ Tatmin edici
Fluoranthene	2.4	2.9	0.83	✅ Tatmin edici
Indeno(1,2,3-cd)pyrene	1.7	2.3	1.33	✅ Tatmin edici
Phenanthrene	3.7	4.9	1.26	✅ Tatmin edici
Pyrene	1.8	2.2	0.89	✅ Tatmin edici

Tablo 5. Tütsülenmiş et referans materyalinden elde edilen PAH sonuçları.

Analit	Atanmış Değer (µg/kg)	ETHOS X (µg/kg)	Z-skoru	Sonuç
Benzo(a)anthracene (BaA)	18.2	17.8	-0.09	✅ Tatmin edici
Benzo(a)pyrene (BaP)	15.7	20.8	1.29	✅ Tatmin edici
Benzo(b)fluoranthene (BbF)	13.9	11.5	-0.69	✅ Tatmin edici
Chrysene (CHR)	25.4	21.2	-0.66	✅ Tatmin edici
TOPLAM (BaA, BaP, BbF, CHR)	68.3	71.3	0.18	✅ Tatmin edici

Tablo 6. Kakao referans materyalinden elde edilen PAH sonuçları.*Yağ başına μg/kg olarak ifade edilmiştir.

Analit	Atanmış Değer (µg/kg)	ETHOS X (µg/kg)	Z-skoru	Sonuç
Benzo(a)anthracene (BaA)	1.2	1.1	-0.33	✅ Tatmin edici
Benzo(a)pyrene (BaP)	1.4	1.7	0.86	✅ Tatmin edici
Benzo(b)fluoranthene (BbF)	1.6	1.6	0.00	✅ Tatmin edici
Benzo(ghi)perylene	1.7	1.7	0.00	✅ Tatmin edici
Benzo(k)fluoranthene	1.9	2.1	0.40	✅ Tatmin edici
Chrysene (CHR)	1.8	1.7	-0.22	✅ Tatmin edici
TOPLAM (BaA, BaP, BbF, CHR)	5.9	6.3	0.27	✅ Tatmin edici
Dibenzo(a,h)anthracene	1.8	1.4	-0.89	✅ Tatmin edici
Indeno(1,2,3-cd)pyrene	2.2	2.4	0.36	✅ Tatmin edici

Tablo 7. Kakao referans materyalinden elde edilen PAH sonuçları.

Amaç: Yöntemin tekrarlanabilirliğini (repeatability) görmek için 6 tekrar (replicate) yapılmıştır.

• Tüm analiz edilen bileşiklerde sonuçlar tatmin edici (satisfactory) bulunmuştur.

• Kurtarımlar (recoveries) Tablo 8’de gösterilmiştir.

Analyte	Atanmış Değer (μg/kg)	ETHOS X (μg/kg)	Recovery (%)	SD (μg/kg), N=6
Benzo(a)anthracene (BaA)	19.2	16.9	87.8	0.89
Chrysene (CHR)	26.9	23.7	88.0	1.57
Benzo(b)fluoranthene (BbF)	35.8	32.7	91.3	0.37
Benzo(a)pyrene (BaP)	18.2	17.7	97.5	0.62
SUM (BaA+BaP+BbF+CHR)	100.1	91.0	90.9	—

Tablo 8. IAEA 451 – Dondurularak kurutulmuş biyota referans materyalinden elde edilen PAH sonuçları (altı tekrar).

Sonuç

• Verimlilik: Sonuçlar, ETHOS X ve FastEX-24 eT rotorunun gıda örneklerinde PAH ekstraksiyonunda yüksek verimlilik sağladığını göstermiştir.

• Direkt Ekstraksiyon: Bu çalışmada doğrudan ekstraksiyon yöntemi uygulanmıştır. Ancak analiz cihazını korumak ve duyarlılık kaybını önlemek için sonrasında arıtma (purification) gereklidir.

• Yüksek Kapasite & Hız: ETHOS X + FastEX-24 eT ile 50 dakikada aynı anda 24 örnek çözücü ile ekstrakte edilebilmektedir. Buna karşılık geleneksel Soxhlet ekstraksiyonu çok daha uzun zaman ve yüksek çözücü tüketimi gerektirir.

• Pratiklik & Temizlik: FastEX-24 eT’de kullanılan tek kullanımlık cam vialler, kontaminasyonu, bellek etkisini (memory effects) ve temizlik ihtiyacını ortadan kaldırır.

• Tekrar Edilebilirlik: Temassız sıcaklık kontrolü sayesinde ekstraksiyon sürecinde yüksek tekrarlanabilirlik sağlanır.

• Ekstra Verimlilik: SFS-24 (Simultaneous Filtration System), 24 örneğin aynı anda filtrelenmesine olanak vererek laboratuvar verimliliğini daha da artırır.

• Avantaj: ETHOS X, minimum çözücü kullanımı ve kayda değer zaman tasarrufu ile laboratuvarlar için güçlü bir alternatiftir.

Kaynak: Milestone SRL