ZymoPURE™ 96 Plazmid Miniprep Kiti ile Otomatik Ultra Saf Plazmid DNA Hazırlama
- URL Kopyalandı
Otomatik plazmid saflaştırma, bakteriyel kültürlerden transfeksiyon kalitesinde plazmid DNA izolasyonunu kolaylaştıran devrim niteliğinde bir tekniktir. Otomatik sıvı işleme ile gelişmiş saflaştırma yöntemlerini birleştirerek, emek yoğun manuel adımları ortadan kaldırır, insan hatalarını azaltır ve verimi artırır. Geleneksel olarak, memeli hücre transfeksiyonu için yeterince saf plazmid DNA elde etmek; yavaş yerçekimi akışlı kolonlar, zahmetli çöktürme adımları ve birden fazla kültürleme ve doğrulama turu gerektirdiğinden önemli bir darboğaz oluşturuyordu ve bu da süreci yüksek kapasiteli iş akışları için uygunsuz hale getiriyordu. Otomasyon, moleküler biyoloji alanını dönüştürerek araştırmacıların klonlama, gen ekspresyon çalışmaları ve genetik mühendislik gibi çeşitli uygulamalar için yüksek kaliteli plazmid DNA’yı büyük miktarlarda verimli bir şekilde elde etmesini sağlamıştır.
Zymo Research tarafından geliştirilen ZymoPURE 96 Plasmid Miniprep Kiti, modifiye alkalin lizis yöntemi ve yüksek bağlanma kapasiteli yeni bir kimya kullanarak plazmid saflaştırma sürecini optimize eder ve 100 µg’a kadar ultra saf, transfeksiyon kalitesinde plazmid DNA elde edilmesini sağlar. Bu süreç, EZ-Vac 96 vakum manifoldu ile donatılmış ASSIST PLUS pipetleme robotu üzerinde VIAFLO elektronik pipet kullanılarak otomatik hale getirilebilir; böylece kullanıcı hataları ortadan kaldırılır ve yüksek kapasiteli uygulamalar için zahmetli sıvı işleme adımları önemli ölçüde azaltılır. Bu uygulama notunda, ZymoPURE 96 Plasmid Miniprep Kitinin otomatik ASSIST PLUS üzerinde kullanımıyla yüksek bağlanma kapasitesi ve yüksek verimli, ultra saf plazmid DNA elde etme performansı gösterilmektedir.
Temel avantajlar
- ASSIST PLUS pipetleme robotu üzerinde entegre vakum manifoldu kullanılarak ZymoPURE 96 Plasmid Miniprep Kiti ile 96 örneğin güvenilir ve yüksek kapasiteli işlenmesi.
- Otomatik iş akışı hataları ortadan kaldırır ve kullanıcıyı zaman alıcı sıvı işleme adımlarından kurtarır; VIAFLO elektronik pipet ise ASSIST PLUS üzerinde doğru ve hassas sıvı transferini garanti eder.
- ZymoPURE’un patentli teknolojisi, transfeksiyon, transformasyon, CRISPR, dizileme ve diğer hassas aşağı akış uygulamaları için uygun, yüksek konsantrasyonlu plazmid DNA sağlar.
- Ayrı yıkama plakalarıyla optimize edilmiş yıkama süreci, çapraz kontaminasyonu azaltır ve endotoksinler, tuzlar, proteinler ve RNA’dan arındırılmış, ultra saf ve transfeksiyon kalitesinde plazmid DNA elde edilmesini sağlar.
Genel bakış: ASSIST PLUS üzerinde ZymoPURE 96 kiti ile plazmid miniprep otomasyonu
Bu uygulama notu, ZymoPURE 96 Plasmid Miniprep Kiti ve EZ-Vac 96 vakum manifoldu ile donatılmış ASSIST PLUS pipetleme robotu kullanılarak, gece boyunca büyütülmüş E. coli JM109 (pGL3®) kültüründen 5 ml’ye kadar hacimden plazmid saflaştırılmasına yönelik otomatik miniprep protokolünü açıklamaktadır.
Deneysel kurulum
ASSIST PLUS, 8 kanallı 1.250 µl VIAFLO elektronik pipet ve 1.250 µl steril, filtreli GRIPTIPS® pipet uçları ile birlikte kullanılarak, aşağıdaki adımlardan oluşan tek bir program içinde tüm sıvı işleme adımlarını otomatikleştirir (Şekil 1):
- Kültür pelletinin lizisi ve nötralize edilmiş lizatların filtrelenmesi
- Plazmid DNA’nın bağlanması
- Plazmid DNA’nın yıkanması
- Plazmid DNA’nın elüsyonu
Şekil 1: Otomatik miniprep protokolünün adımları.
Adım adım prosedür
Kültür pelletlerinin lizisi ve nötralize edilmiş lizatların filtrelenmesi
Otomasyona uygun 8 sıralı rezervuar insertü ve tabanını dikey yönde pozisyon A’ya yerleştirin (Şekil 2). ZymoPURE P1’in tüm şişe hacmini (en az 28 ml) sütun 1’e (Şekil 2, kırmızı), ZymoPURE P2’yi sütun 2’ye (Şekil 2, açık mavi), ZymoPURE P3’ü sütun 3’e (Şekil 2, sarı) ve ZymoPURE binding buffer’ı sütun 4’e (Şekil 2, açık yeşil) ekleyin. Her kuyucuğunda E. coli pelletleri bulunan derin kuyucuklu plakayı (DWP) yatay yönde pozisyon B’ye yerleştirin (Şekil 2, turuncu).
EZ-Vac 96 vakum manifoldu, ZymoPURE 96 Plasmid Miniprep Kiti ile sağlanan laboratuvar ekipmanları kullanılarak 3 farklı şekilde kurulabilir:
EZ-Vac 96 kurulum A (Şekil 3)
EZ-Vac 96 kurulum B (Şekil 6)
EZ-Vac 96 kurulum C (Şekil 3)
İlk olarak, Şekil 3a’da gösterildiği gibi EZ-Vac 96 kurulum A’yı hazırlayın. DWP ile birlikte manifold yatağını pozisyon C’ye yerleştirin (Şekil 3a) ve üzerine ZymoPURE filtre plakasını taşıyan manifold yakasını yerleştirin (Şekil 3b). Hortumu vakum pompasına bağlayın.
İpuçları:
Numuneler farklı laboratuvar ekipmanı formatları arasında aktarılabilir. MINI 96 veya VIAFLO 96 elektronik pipetlerle E. coli kültürü, otomasyona uygun bir rezervuardan DWP’ye tek adımda aktarılabilir.
Ortam aktarımı ve inokülasyon, MINI 96 veya VIAFLO 96 ile hızlandırılabilir.
Şekil 2: EZ-Vac 96 kurulum A ile deck düzeni.
Pozisyon A: Reaktifler – tabanlı 8 sıralı polipropilen rezervuar insertü (kırmızı – ZymoPURE P1; açık mavi – ZymoPURE P2; sarı – ZymoPURE P3; açık yeşil – ZymoPURE bağlama tamponu).
Pozisyon B: Kaynak – E. coli pelletleri içeren derin kuyucuklu plaka (DWP) (turuncu).
Pozisyon C: Hedef – EZ-Vac 96 kurulum A.
‘ZymoPURE_plasmid_isolation_below_3ml’ (3 ml altı kültürler için) veya ‘ZymoPURE_plasmid_isolation_above_3ml’ (3–5 ml kültürler için, maks. 5 ml) VIALAB programını seçip çalıştırın. ASSIST PLUS üzerindeki VIAFLO, pozisyon A’daki rezervuarın 1. sütunundan (Şekil 2, kırmızı) 250 µl ZymoPURE P1’i alarak pozisyon B’deki DWP’ye aktarır (Şekil 4a-b). Farklı giriş hacimlerinde homojenliği sağlamak için tüm E. coli pelletleri hız 10’da 50 kez karıştırılır ve VIAFLO sütunlar arasında otomatik olarak GRIPTIPS değiştirir.
Ardından VIAFLO, 8 sıralı rezervuarın 2. sütunundan (Şekil 2, mavi) 250 µl ZymoPURE P2’yi alarak pozisyon B’deki DWP’ye aktarır (Şekil 4a, 4c). ZymoPURE P1 ile oluşan kırmızı E. coli süspansiyonu, ZymoPURE P2 ile hız 8’de 10 kez karıştırılır ve çözelti berrak mor renge dönene kadar lizis gerçekleştirilir.
Lizis, pozisyon A’daki rezervuarın 3. sütunundan (Şekil 2, sarı) alınan 250 µl ZymoPURE P3’ün DWP’ye aktarılmasıyla durdurulur (Şekil 5a). Her kuyucuk, uygun nötralizasyonu sağlamak için hız 3’te 13 kez karıştırılır ve karışım sarımsı bir renk alır.
Lizatlar (çökeltiler dahil), VIAFLO tarafından pozisyon B’deki DWP’den alınarak pozisyon C’deki ZymoPURE filtre plakasına aktarılır (Şekil 5b) ve ardından 5 dakika inkübe edilir. Pipet, berraklaştırılmış lizatı toplamak için operatöre vakumu 5 dakika boyunca açmasını bildirir.
İpucu:
‘ZymoPURE_plasmid_isolation_above_3ml’ programında, nötralizasyonun tamamlanmasına yardımcı olmak için karıştırma sayısı 13’e çıkarılır ve karıştırma hızı 2’ye düşürülür.
Şekil 4:
a) Pozisyon A’da dikey yerleşimde bulunan, tabanlı 8 sıralı bölmeli reaktif rezervuarı ve içindeki reaktifler.
b) ve c) ASSIST PLUS üzerindeki DWP’ye VIAFLO tarafından sırasıyla ZymoPURE P1 ve ZymoPURE P2’nin aktarılması.
Şekil 5: ASSIST PLUS üzerindeki VIAFLO’nun a) ZymoPURE P3’ü DWP’ye ve b) lizatı ZymoPURE filtre plakasına aktarması.
Plazmid DNA’nın bağlanması
Operatöre, EZ-Vac 96 kurulum A’nın (Şekil 3b) sökülmesi ve pozisyon B’deki boş DWP’nin, berraklaştırılmış lizatları içeren DWP ile değiştirilmesi talimatı verilir. ZymoPURE filtre plakası atılır ve pozisyon A’daki 8 sıralı reaktif rezervuarı yerinde bırakılır (Şekil 4a).
EZ-Vac 96 kurulum B, manifold tabanı (yıkama plakası ile birlikte) pozisyon B’ye yerleştirilerek hazırlanır (Şekil 6a). Üzerine manifold yakası ve Zymo-Spin P-96 plakası yerleştirilir (Şekil 6b). Hortum, toplama şişesine bağlanır.
Onay verilip çalışma devam ettirilir. VIAFLO, pozisyon A’daki reaktif rezervuarının 4. sütunundan (Şekil 2, açık yeşil) 220 µl ZymoPURE bağlama tamponunu alarak pozisyon B’deki DWP’nin her kuyucuğuna aktarır ve her berrak lizatı 10 kez karıştırır. Oluşan karışım daha sonra pozisyon C’deki Zymo-Spin P-96 plakasına transfer edilir. Lizatlar 2 dakika inkübe edildikten sonra, pipet operatöre vakumu açmasını ve tüm sıvı geçene kadar beklemesini bildirir.
İpucu:
ZymoPURE_plasmid_isolation_above_3ml programı kullanıldığında, berrak lizat hacmi daha düşük olduğundan ZymoPURE bağlama tamponu hacmi 165 µl’ye düşürülür.
Şekil 6: ASSIST PLUS üzerinde EZ-Vac 96 kurulum B.
a) Hortum bağlantısına sahip manifold tabanı, yıkama plakasını barındırır ve deck pozisyonu C’ye yerleştirilir.
b) Hortum bağlantısı olmayan manifold yakası, yıkama plakası üzerine yerleştirilir ve Zymo-Spin P-96 plakasını barındırır.
Plazmid DNA’nın yıkanması
VIAFLO, operatöre pozisyon A’ya yerleştirilmek üzere yeni bir otomasyona uygun 8 sıralı reaktif rezervuarı hazırlamasını bildirir: sütun 1–3’e 27 ml ZymoPURE Wash 1 (Şekil 7, lila), sütun 4–6’ya 27 ml ZymoPURE Wash 2 (Şekil 7, mavi), sütun 7’ye 21 ml ZymoPURE Wash 2 (Şekil 7, mavi) ve sütun 8’e 14 ml ZymoPURE elüsyon tamponu (Şekil 7, yeşil) eklenir. Pozisyon B’deki boş DWP kaldırılır.
Pozisyon C’deki Zymo-Spin P-96 plakasının her sütununa 800 µl ZymoPURE Wash 1 (Şekil 7, lila) eklenir. Tüm Wash 1 aktarıldıktan sonra, sistem operatöre vakum pompasını açmasını ve tüm sıvı geçene kadar beklemesini bildirir. Vakum kapatıldıktan sonra, VIAFLO aynı işlemi ikinci yıkama adımı için tekrarlar ve pozisyon A’daki rezervuarın 4–6. sütunlarından 800 µl ZymoPURE Wash 2 (Şekil 7, mavi) aktarır.
Operatör tekrar vakumu açarak tüm sıvının geçmesini sağlar. Ardından VIAFLO, üçüncü yıkama adımı olarak rezervuarın 7. sütunundan 200 µl ZymoPURE Wash 2’yi (Şekil 7, mavi) her kuyucuğa aktarır. Pipet, membranı kurutmak için operatöre maksimum vakum gücünü (>600 mm Hg) 10 dakika boyunca uygulamasını bildirir.
Daha sonra EZ-Vac 96 kurulum B sökülür ve Zymo-Spin P-96 plakasının nozulları, kalan tampon damlacıklarını gidermek için temiz emici kağıt ile kurulanır.
İpucu:
Etanol içeren tamponlarla çalışırken hedef plakada “tip touch” yapılması, damlacıkların tamamen uzaklaştırılmasını sağlar.
Şekil 7: EZ-Vac 96 kurulum B ile deck düzeni.
Pozisyon A: Reaktifler – tabanlı 8 sıralı polipropilen rezervuar (lila – ZymoPURE Wash 1; mavi – ZymoPURE Wash 2; yeşil – ZymoPURE elüsyon tamponu).
Pozisyon B: Boş.
Pozisyon C: Hedef – EZ-Vac 96 kurulum B.
Zymo-Spin P-96 plakasından plazmid DNA’nın elüsyonu
EZ-Vac 96 kurulum C’yi, manifold yatağını ve yeni bir DWP’yi pozisyon C’ye yerleştirerek hazırlayın (Şekil 3a). DWP üzerine Zymo-Spin P-96 plakasını içeren manifold yakasını yerleştirin (Şekil 3b) ve hortumu vakum pompasına bağlayın.
Onaydan sonra VIAFLO, pozisyon A’daki reaktif rezervuarının son sütunundan (Şekil 7, yeşil) 125 µl ZymoPURE elüsyon tamponunu Zymo-Spin P-96 plakasının her sütununa aktarır. 2 dakika sonra pipet, operatöre maksimum vakumu 30 saniye uygulamasını bildirir ve çalışma tamamlandığında bilgilendirir. EZ-Vac 96 kurulum C sökülür ve Zymo-Spin P-96 plakası atılır. İzole edilen plazmid DNA’yı içeren DWP, kit protokolüne uygun şekilde kapatılır ve saklanır.
Deney
Yukarıda açıklanan 1 ml E. coli JM109 (pGL3) kültüründen 96 örnek için otomatik miniprep protokolü, benzer bir manuel yöntemle karşılaştırılmıştır. E. coli JM109 (pGL3), kit protokolünde belirtildiği şekilde 100 µg/ml ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) besiyerinde, 37 °C’de ve 250 RPM’de çalkalamalı inkübasyonda gece boyunca kültüre edilmiştir. 1 ml kültür, sağlanan DWP’ye aktarılmış ve kit protokolüne göre santrifüj edilmiştir. Ayrıca 5 ml kültür girişi de test edilmiş; bu amaçla birden fazla santrifüj adımı ile pellet elde edilmiş ve otomatik miniprep protokolünde daha düşük hacimde ZymoPURE bağlama tamponu kullanılmıştır.
Sonuçlar
Elüe edilen plazmid DNA’nın (n=96) verim ve saflığı Nanodrop spektrofotometre ile ölçülmüştür. Toplam plazmid DNA verimi ve saflaştırılmış DNA miktarı, hem 1 ml hem de 5 ml kültürler için tutarlı şekilde yüksek bulunmuş ve dizileme ile memeli hücre transfeksiyonu uygulamaları için yeterli olmuştur. 5 ml kültürden elde edilen ortalama plazmid DNA verimi, 1 ml kültüre göre yaklaşık 5 kat daha fazladır (1 ml’den 15,3 µg, 5 ml’den 69,7 µg) (Şekil 9).
Yüksek absorbans oranları (saf DNA için 260/280 oranı >1,8 ve 260/230 oranı >2,0), otomatik plazmid saflaştırma protokolünün proteinleri ve istenmeyen kimyasalları etkin şekilde uzaklaştırdığını göstermektedir. Her plakadan rastgele seçilen 12 örnek, %0,8 TE agaroz jel üzerinde 120 volt altında 120 dakika jel elektroforezine tabi tutulmuş ve pGL3 kontrol plazmidinin tutarlı şekilde saflaştırıldığını göstermiştir (Şekil 10). Elde edilen plazmidlerin büyük çoğunluğu süpercoil formda olup, bu form transfeksiyon için tercih edilmektedir.
Uzun okuma nanopore dizileme, plazmid DNA’nın tüm plazmid dizilemesi ile uyumlu olduğunu doğrulamıştır. Nanopore dizileme sonuçları, elde edilen plazmidin doğru dizilime sahip olduğunu, genomik DNA içermediğini ve hassas aşağı akış uygulamaları için uygun saflıkta olduğunu göstermiştir (Şekil 8).
Şekil 8: Otomatik ZymoPURE 96 Plasmid Miniprep protokolü kullanılarak 5 ml gece boyunca büyütülmüş E. coli kültüründen saflaştırılan plazmid DNA’nın okuma uzunluğu dağılımı.
Hiçbir Paylaşımı Kaçırmayın
Haberlerden ve gelişmelerden ilk siz haberdar olmak istiyorsanız hemen bültenimize abone olabilirsiniz.
