Hücre Kültürü Uygulamaları için Corning Matrigel® İnce Kaplama Protokolünün Otomasyonu

URL Kopyalandı

Corning Matrigel Matrix, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomu hücrelerinden elde edilen bir bazal membran ekstraktıdır. Organoid büyümesi ve çeşitli adezyon gösteren hücre tiplerinin farklılaşması dahil olmak üzere hem 2D hem de 3D hücre kültürü uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu uygulama notu, Matrigel’in serum içermeyen ortamda seyreltilerek hücre tutunması ve proliferasyonu için substrat görevi gören kompleks bir protein tabakası oluşturduğu 96 kuyucuklu plakaların ince kaplanmasına odaklanmaktadır.

Matrigel 10 °C’nin üzerindeki sıcaklıklarda polimerize olduğundan, erken jel oluşumunu önlemek ve hassas sıvı transferini sağlamak için sıkı sıcaklık kontrolü gereklidir. Bu çalışmada, ASSIST PLUS pipetleme robotunun COLDPLATE modülü ve VOYAGER ayarlanabilir uç aralıklı pipet ile birlikte kullanılarak 96 kuyucuklu plakaların Matrigel ile ince kaplanması için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir çözüm sunduğu gösterilmektedir.

Temel avantajlar

Sıcaklık kontrollü, kabarcıksız dağıtım: COLDPLATE modülü ile aktif soğutma, Matrigel’in erken polimerizasyonunu önleyerek tutarlı işlem sağlar. VIALAB yazılımında kolayca programlanabilen INTEGRA pipetlerinin ön ve son dağıtım (pre/post-dispense) adımları, kabarcık oluşumunu engeller ve düşük sıcaklıklarda Matrigel’in viskozitesinden kaynaklanan hataları azaltır.
Hızlı ve tekrarlanabilir pipetleme: VOYAGER pipeti ile ASSIST PLUS kombinasyonu, manuel iş yükünü azaltırken verimli ve homojen plaka kaplaması sağlar.
Tüplerden plakalara esnek dağıtım: Ayarlanabilir uç aralığı özelliği, Matrigel’in kaynak tüplerden 96 kuyucuklu plakalara otomatik aktarımını mümkün kılar.
Steril iş akışı: ASSIST PLUS’ın kompakt tasarımı, biyogüvenlik kabinleri veya laminar akış kabinleri içinde kullanıma uygundur ve kaplama süreci boyunca steril koşulların korunmasını sağlar.

Genel bakış: ASSIST PLUS ve COLDPLATE ile 96 kuyucuklu plakaların Matrigel ince kaplama otomasyonu

Bu uygulama notu, 96 kuyucuklu plakaların ince şekilde kaplanması için Matrigel dağıtımının nasıl verimli ve güvenilir şekilde otomatikleştirileceğini göstermektedir. COLDPLATE modülü Matrigel’i 4 °C’de tutarken, 6 kanallı 1.250 µl VOYAGER pipet, Matrigel’i 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerinden alarak 96 kuyucuklu hücre kültürü plakasına aktarır (Şekil 1).

Şekil 1: COLDPLATE üzerindeki kaynak tüplerden 96 kuyucuklu hücre kültürü plakasına Matrigel transferi için ASSIST PLUS deck düzeni.

Pozisyon A: Boş.
Pozisyon B: Hedef – 96 kuyucuklu düz tabanlı plaka (mavi, siyah noktalı).
Pozisyon C: Kaynak – 6 adet 1,5 ml tüp içeren 1,5 ml tüp adaptörlü COLDPLATE (açık mavi).

Adım adım prosedür

Şekil 2: Matrigel ince kaplama iş akışı.

Matrigel hazırlığı

Corning Matrigel bazal membran matriksi ile çalışmaya başlamadan önce, bu yüksek derecede sıcaklık hassasiyeti olan maddenin doğru şekilde nasıl kullanılacağını anlamak önemlidir. Matrigel 10 °C’nin üzerinde jel oluşturmaya başladığından, tüm işlemler buz üzerinde yapılmalı ve temas edecek tüm laboratuvar malzemeleri ile ortamlar önceden soğutulmalıdır. Ancak buz, otomatik iş akışları için ideal değildir; bu nedenle COLDPLATE, Matrigel’in süreç boyunca sürekli olarak 4 °C’de tutulmasını sağlayan uygun bir alternatiftir.

Matrigel’i hazırlamak için vial’i buz üzerinde veya 4 °C’de bir buzdolabında gece boyunca çözündürün. Vial’i nazikçe çalkalayın, ardından Matrigel’i buz üzerinde önceden soğutulmuş tüplere alikotlayın. Matrigel’in polimerizasyonunu önlemek için hem tüplerin hem de pipet uçlarının önceden soğutulmuş olması gerekir; ideal olarak bu malzemeler bir gece önceden buzdolabında bekletilmelidir. Alikotları -20 °C veya -70 °C’de saklayın ve tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kaçının.

Matrigel’i serum içermeyen Gibco™ DMEM ile 1 mg/ml son konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. İnce kaplama protokolü, uygulamaya bağlı olarak farklı serum içermeyen ortamlar ve farklı konsantrasyonlarla uyarlanabilir. Corning Matrigel matriksinin protein içeriğinin partiden partiye değişebileceğini unutmayın; kesin konsantrasyon Analiz Sertifikasında belirtilir. Bu çalışmada stok konsantrasyon 11,8 mg/ml’dir.

Matrigel kullanımıyla ilgili daha fazla bilgi için Corning kılavuzuna (SPC-354234.pdf) başvurun.

COLDPLATE soğutma ve Matrigel seyreltilmesi

ASSIST PLUS deck üzerinde, 96 kuyucuklu düz tabanlı plakayı pozisyon B’ye ve 1,5 ml tüp adaptörlü COLDPLATE’i pozisyon C’ye, her ikisi de dikey (portrait) konumda yerleştirin (Şekil 1). Corning, ekstraselüler matriks (ECM) kaplamaları için hücre kültürü işlemine uygun (tissue culture-treated) plakaların kullanılmasını önerir; bu, kaplama kalitesini ve hücre adezyonunu artırır. Adaptördeki A1–A6 pozisyonlarına altı adet 1,5 ml mikrosantrifüj tüp yerleştirin. 1.250 µl steril, filtreli GRIPTIPS uçları bir gece önceden 4 °C’de soğutulmalı ve yalnızca COLDPLATE 4 °C’ye ulaştıktan sonra sisteme takılmalıdır.

6 kanallı 1.250 µl VOYAGER pipeti ASSIST PLUS’a monte edin ve ardından “Matrigel_thin_coating_96” VIALAB programını seçip çalıştırın. Bu aşamada COLDPLATE 4 °C’ye soğumaya başlayacaktır. Bu sıcaklığa ulaşması yaklaşık 12 dakika sürdüğünden, bu süre Matrigel seyreltilmesini hazırlamak için kullanılabilir.

Matrigel stok çözeltisini buz üzerinde veya 4 °C’de bir buzdolabında gece boyunca çözündürün. Önceden soğutulmuş pipet uçları ve serolojik pipetler kullanarak, Matrigel’i buz üzerinde, önceden soğutulmuş 15 ml tüp içinde serum içermeyen ortam ile 1 mg/ml’ye manuel olarak seyreltin. Her biri 1.200 µl içerecek şekilde 6 mikrosantrifüj tüpünü dolduracak kadar seyreltilmiş çözeltiden hazırlayın.

COLDPLATE 4 °C’ye ulaştığında, sistem sizi kaynak tüpleri doldurmanız için uyaracaktır. Dağıtım sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için, 50 µl post-dispense hacmi ile ters pipetleme (reverse pipetting) modunda tek kanallı 1.250 µl VIAFLO elektronik pipet kullanılması önerilir.

İpucu:
Matrigel, 10 ml’lik bir rezervuarda da seyreltilip, ASSIST PLUS sürecinde kullanılan aynı 6 kanallı 1.250 µl VOYAGER pipet ile kaynak tüplere aktarılabilir.

Matrigel dağıtımı

Seyreltilmiş Matrigel kaynak tüplere doldurulduktan ve VOYAGER üzerinde Run tuşuna basıldıktan sonra, cihaz kullanıcıdan 4 °C’de önceden soğutulmuş GRIPTIPS uçlarını yerleştirmesini ister ve programa devam edilmesi için tekrar Run komutu verilir. VOYAGER, uçları ön ıslatmak ve Matrigel’i homojen hale getirmek için iki kez karıştırma yapar (Şekil 3), ardından 96 kuyucuklu plakanın 7–12. sıralarına 65 µl dağıtır. Daha sonra Matrigel tekrar karıştırılır ve kalan sıralara (1–6) her birine 65 µl olacak şekilde dağıtım yapılır.

Matrigel’in fiziksel özellikleri ve düşük sıcaklık koşulları, VOYAGER pipetinin kalibrasyon koşullarının dışında kaldığından, değişkenlik artabilir ve doğruluk azalabilir. Bu nedenle her iki tekrarlı dağıtım adımında da 50 µl ön dağıtım (pre-dispense) ve son dağıtım (post-dispense) hacimleri kullanılır.

Ön dağıtım, pipetin rotorundan kaynaklanan hataların birikmesini azaltarak ilk dağıtımın doğruluğunu artırır. Son dağıtım ise 4 °C’de seyreltilmiş Matrigel’in çoklu dağıtımı sırasında gözlenen sıvı uzaması (stringing) nedeniyle oluşan pipetleme hatalarını telafi eder. Bu yaklaşım, son dağıtım için yeterli Matrigel kalmasını ve kuyucuklara hava kabarcığı girmemesini sağlamak açısından kritik öneme sahiptir.

Şekil 3: ASSIST PLUS üzerindeki VOYAGER, Matrigel’i nazikçe karıştırarak homojen hâle getirir.

İnkübasyon ve bağlanmamış materyalin uzaklaştırılması

Son tekrarlı dağıtım tamamlandıktan ve pipet uçları atıldıktan sonra, cihaz kullanıcıyı kaynak tüplerde kalan Matrigel’i önceden soğutulmuş uçlar kullanarak dikkatlice geri toplaması için uyarır. Run tuşuna basıldığında COLDPLATE kapanır ve VIALAB programı tamamlanır. Plaka, Matrigel’in katılaşması için oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.

İnkübasyonun ardından, bağlanmamış sıvı aspire edilir ve kuyucuklar serum içermeyen ortam ile nazikçe yıkanır. Kaplanmış plakalar artık hücre kültürü uygulamaları için hazırdır.

Bu uygulama notu, ince kaplama protokolü kapsamında Matrigel’in otomatik dağıtımına odaklanmaktadır. Jel oluşturmamış tabakanın değerlendirilmesine yönelik biyolojik veya hücre kültürü testleri gibi sonraki adımlar burada ele alınmamıştır.

İpuçları:

Dağıtımdan sonra Matrigel’in her kuyucuğun yüzeyine eşit şekilde yayılması için plakayı nazikçe döndürün veya hafifçe vurun.
Kaplanmış plakalar, serum içermeyen ortam tabakası ile kaplanarak ve parafilm ile mühürlenerek 2–8 °C’de saklanabilir.

Sonuçlar

Matrigel ile çalışmak, yüksek viskozitesi ve sıcaklığa duyarlılığı nedeniyle zordur; bu durum hatalı dağıtıma, kabarcık oluşumuna ve zaman kaybına yol açabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için INTEGRA, Matrigel ince kaplama protokolünün verimliliğini artırmak amacıyla üç aracı bir araya getirir: ASSIST PLUS, COLDPLATE ve VOYAGER pipet.

Corning Matrigel (11,8 mg/ml), serum içermeyen Gibco DMEM ile 1 mg/ml son protein konsantrasyonuna seyreltilmiştir. Corning, ince kaplama protokolü için gerekli hacmi belirtmediğinden, farklı dağıtım hacimleri manuel olarak değerlendirilmiş ve 65 µl’nin büyüme yüzeyini güvenilir şekilde kapladığı ve aynı zamanda reaktif tüketimini minimize ettiği belirlenmiştir. Bu durum, Matrigel’in yüksek maliyeti göz önüne alındığında önemli bir avantajdır.

Yukarıda açıklanan şekilde ASSIST PLUS kullanıldığında, dağıtım sırasında kabarcık oluşumu gözlenmemiş ve tüm kuyucukların Matrigel ile homojen şekilde kaplandığı görülmüştür (Şekil 4).

Şekil 4: Matrigel dağıtımı sonrasında 96 kuyucuklu plaka ile ASSIST PLUS.

DMEM’de bulunan bir vitamin olan riboflavinin floresansı, dağıtım doğruluğunu doğrulamak amacıyla ölçülmüştür. Elde edilen RFU değerleri, özel olarak oluşturulmuş bir standart eğri kullanılarak mikrolitre cinsine dönüştürülmüştür.

65 µl dağıtım hacmi ve Matrigel’in özgün fiziksel özellikleri nedeniyle gerekli olan düşük pipetleme sıcaklığı, VOYAGER pipetinin kalibrasyon aralığının dışında kalmaktadır ve çoklu dağıtım adımlarında dalgalanmalara yol açabilir. Beklendiği gibi, ortalama dağıtılan hacim hedeflenen 65 µl’den biraz daha yüksek bulunmuştur (Ek bölüm), bu durum seyreltilmiş Matrigel’in uçlardan yavaşça akma eğilimini yansıtmaktadır.

Bu küçük hacim artışı, kaplama sürecinin güvenilirliğini olumsuz etkilememektedir.

Sonuç

Corning Matrigel’in COLDPLATE ile 4 °C’de tutulması, viskozitenin sabit kalmasını sağlar ve polimerizasyonu önleyerek tüm iş akışı boyunca güvenilir dağıtım imkânı sunar; ayrıca otomatik sistemlere kolay entegrasyon sağlar.
ASSIST PLUS ve ayarlanabilir uç aralığına sahip VOYAGER pipet kombinasyonu, 96 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasına 2 dakikadan kısa sürede hızlı Matrigel dağıtımı yaparak verimliliği artırır.
Optimize edilmiş iş akışı, uç kullanımını minimize ederek sarf malzeme maliyetlerini ve atıkları azaltır; bu da kaplama sürecinin güvenilirliğinden ödün vermeden daha ekonomik bir çözüm sunar.
VIALAB yazılımı, pipet mekaniklerinden ve viskoz/soğuk sıvılardan kaynaklanan değişkenliği dengelemek için 50 µl ön ve son dağıtım hacimlerinin kolayca ayarlanmasını sağlar ve tekrarlı dağıtımlarda optimum performans sunar.
COLDPLATE 4 °C’ye soğurken Matrigel’in hazırlanması ve seyreltilmesi, iş akışını hızlandırır ve zaman tasarrufu sağlar.

Kaynak:https://www.integra-biosciences.com/global/en/applications/automating-corning-matrigelr-thin-coating-protocol-cell-culture-applications