ASSIST PLUS Pipetleme Robotu ve Simple Western™ ile Western Blot Protokolünün Otomasyonu

Otomatik western blotlama, geleneksel protein tespiti ve analizini dönüştüren ileri düzey bir teknolojidir. Robotik sistemler, mikroskobik ölçekli ayırma ve gelişmiş görüntüleme teknolojilerinin kullanılması, western blot sürecinin emek yoğun ve zaman alıcı adımlarını önemli ölçüde kolaylaştırır. İş akışındaki çoklu adımların otomatikleştirilmesi verimliliği artırır ve bu yöntemi biyolojik araştırmaların birçok alanında vazgeçilmez hale getirir.

ProteinSimple (Bio-Techne markası) tarafından geliştirilen Simple Western™, piyasadaki tek tamamen otomatik western blot çözümüdür. Gelişmiş kapiler tabanlı teknoloji, tüm analiz reaktifleri ve örneklerin tek bir plaka içinde bulunduğu yüksek verimli protein ayrımı, tespiti ve kantifikasyonunu mümkün kılar. Simple Western testleri; kanser ve immüno-onkoloji, hücre ve gen terapisi, rejeneratif tıp ve hedefe yönelik protein yıkımı gibi birçok alanda araştırma ve geliştirmeyi ilerletmektedir.

ASSIST PLUS pipetleme robotu ve D-ONE tek kanallı pipetleme modülü, Jess™ veya Abby™ gibi Simple Western cihazlarına özel olarak tasarlanmış plakaların kolayca doldurulmasını sağlar ve kullanıcıya %100 “hands-free” çalışma süresi sunarak zahmetli sıvı işleme adımlarını ortadan kaldırır. INTEGRA protokolleri, tek hedef, çoklu hedef (RePlex™ kullanılarak) veya toplam protein analizleri için kemilüminesans tespitine yönelik Simple Western plaka hazırlığını otomatikleştirir. Bu uygulama notu, kemilüminesans tespiti ve toplam protein analizini tek bir RePlex normalizasyon analizinde birleştirerek, üç farklı analiz türü için tamamen otomatik sıvı işleme sürecini açıklamaktadır. Sonuçlar, manuel plaka doldurma ile eşdeğer performans ve benzer düzeyde örnek ile reaktif stabilitesi göstermektedir.

Temel avantajlar

• Tam otomatik (walk-away) western blot iş akışı: ASSIST PLUS pipetleme robotu, D-ONE tek kanallı pipetleme modülü ve Simple Western Jess sistemi birlikte kullanılarak tamamen otomatik bir protokol sağlanır. Ayrıca VIALAB yazılımının esnekliği sayesinde ASSIST PLUS için özel numune hazırlama protokolleri oluşturulabilir.
• Hatasız sıvı transferi ve plaka doldurma: D-ONE’un sıvı seviye algılama (LLD) özelliği ve otomatik GRIPTIPS® uç seçimi, hem düşük hem yüksek hacimli transferlerde yüksek doğruluk ve hassasiyet sağlar.
• Esnek laboratuvar ekipmanı uyumu: VIALAB’ın labware aracı, özel plaka tanımlamalarını kolaylaştırır; D-ONE modülü ise düzensiz kuyucuk yerleşimlerini bile destekler.
• Yüksek verimli ve güvenilir analiz: Simple Western’in gelişmiş kapiler elektroforez immünoassay teknolojisi, tek çalışmada 24 örneğe kadar otomatik western blot analizi sunar ve sonuçlar yaklaşık 3 saat içinde elde edilebilir.
• Gelişmiş tespit ve çoklu analiz: Simple Western’in kemilüminesans ve NIR/IR floresans tespit yöntemleri, yüksek hassasiyet ve çoklu analiz imkânı sağlar. RePlex teknolojisi, tek bir kapilerde iki immünoassay yapılmasına ve toplam protein ölçümü ile doğru normalizasyona olanak tanır.
• Kompakt tasarım: ASSIST PLUS ve Jess cihazlarının küçük boyutları, laboratuvar alanından tasarruf sağlar ve farklı ortamlara kolayca uyum sağlar.

Genel bakış: ASSIST PLUS ile Simple Western Jess plakasının doldurulması

ASSIST PLUS pipetleme robotu ve D-ONE tek kanallı pipetleme modülü, Simple Western Jess sistemi ile birlikte kullanıldığında, 24 örneğin analiz edilmesi için gerekli tüm sıvı işleme adımlarını otomatikleştirir ve western blot protokolü için tamamen kullanıcı müdahalesi gerektirmeyen (walk-away) bir çözüm sunar.

Tüm iş akışı 2 adımdan oluşur (Şekil 1):

• D-ONE ve ASSIST PLUS ile Simple Western Jess plakasının doldurulması
• Simple Western ile protein analizi

Bu uygulama notu, hazırlanmış örnekler ve reaktifler kullanılarak, tek hedef, çoklu hedef (RePlex kullanılarak) ve toplam protein analizleri için kemilüminesans tespitine yönelik Jess plaka doldurma protokollerini sunar ve Simple Western teknolojisi ile güvenilir aşağı akış protein analizini mümkün kılar.

Şekil 1: 2 adımlı western blot otomasyon protokolü.

RePlex kemilüminesans western blot protokolü için plaka kurulumu

Deneysel kurulum:

• Deck Pozisyon A: Yıkama tamponu (mavi)
• Deck Pozisyon B:
  • B1: Antikor seyreltme tamponu (lila), streptavidin-HRP (kırmızı), luminol-peroksit karışımı (sarı), RePlex karışımı (pembe)
  • B2: Primer antikor probu 1 (açık yeşil-1), sekonder antikor probu 1 (yeşil-1), primer antikor probu 2 (açık yeşil-2), sekonder antikor probu 2 (yeşil-2)
  • B3: Biyotin ile işaretli ladder (mor)
  • B4–B6: Hazırlanmış örnekler (turuncu; ok işlem yönünü gösterir)

Şekil 2: RePlex kemilüminesans analizi gerçekleştirmek için Jess plakasının doldurulmasına yönelik deck düzeni.

Pozisyon A: Kaynak – 25 ml rezervuar.
Pozisyon B: Kaynak – 1,5/2 ml (B1–B2) ve 0,5 ml (B3–B6) mikrosantrifüj tüpleri için INTEGRA tüp rafı.
Pozisyon C: Hedef – Simple Western Jess plakası.

RePlex plaka kurulumu (Jess plate set-up for RePlex)

Deck Pozisyon A’ya 25 ml’lik bir rezervuar yerleştirin ve en az 8 ml yıkama tamponu ile doldurun. Deneysel kurulumda belirtildiği gibi, ilgili reaktif ve örnek tüplerini içeren INTEGRA tüp rafını Pozisyon B’ye yerleştirin. Şekil 2’de gösterildiği gibi Jess plakası, Pozisyon C’de yatay (landscape) konumda yer alır. Sıvı seviye algılama (LLD), farklı alikot hacimlerinin kullanılmasını sağlar ve D-ONE, sıvı hacmi yetersiz olduğunda operatörü uyarır.

ASSIST PLUS’a 0,5–300 µl aralıklı D-ONE modülünü takın ve “Jess_plate_setup_RePlex” VIALAB programını çalıştırın. ASSIST PLUS ve D-ONE, 12,5 µl uzunlukta steril, filtreli GRIPTIPS kullanarak Pozisyon B1’deki 2 ml tüpten 10 µl antikor seyreltme tamponunu (Şekil 2, lila) alıp Jess plakasındaki B1–B25, C1, E1 ve F1 kuyucuklarına aktarır (Şekil 3). 1 µl ön ve son dağıtım, kabarcık oluşumunu önleyerek hassas pipetleme sağlar.

D-ONE, farklı reaktifler arasında otomatik uç değiştirerek, Pozisyon B2’deki 1,5 ml tüpten 10 µl primer antikor probu 1’i (Şekil 2, açık yeşil-1) alır ve C2–C25 kuyucuklarına aktarır (Şekil 3; Şekil 4a). Ardından B1’deki ikinci 2 ml tüpten 10 µl streptavidin-HRP/NIR (Şekil 2, kırmızı) D1 kuyucuğuna aktarılır. D2–D25 kuyucukları ise B2’deki sekonder antikor probu 1 (Şekil 2, yeşil-1) ile doldurulur. Aynı şekilde, primer antikor probu 2 (Şekil 2, açık yeşil-2) E2–E25 kuyucuklarına ve sekonder antikor probu 2 (Şekil 2, yeşil-2) F2–F25 kuyucuklarına aktarılır.

300 µl steril, filtreli GRIPTIPS kullanılarak D-ONE, Pozisyon A’daki rezervuardan 500 µl yıkama tamponunu (Şekil 2, mavi) iki adımda Jess plakasındaki ilgili bölmelere aktarır (Şekil 4b; Şekil 3’e bakınız). Düşük hız (5), dağıtım sırasında kabarcık oluşumunu önler. Daha sonra B1’deki 2 ml tüpten 170 µl luminol-peroksit karışımı (Şekil 5, sarı) ve yine B1’deki başka bir tüpten 300 µl RePlex reaktif karışımı (Şekil 5, pembe) ilgili bölmelere aktarılır. RePlex karışımı, kabarcık oluşumunu önlemek için 10 µl ön ve son dağıtım ile iki adımda verilir.

Pozisyon B3’teki 0,5 ml tüpten 5 µl biyotinlenmiş ladder (Şekil 2, mor) A1 kuyucuğuna aktarılır. Şekil 2’de okla gösterildiği şekilde, B4–B6 pozisyonlarındaki 0,5 ml tüplerden hazırlanan örneklerden (Şekil 2, turuncu) 3 µl alınarak A2–A25 kuyucuklarına aktarılır (Şekil 3). Küçük hacimler için hızlı dağıtım (hız 10) doğruluğu artırır.

Son olarak pipet, kullanıcıya plakanın 5 dakika boyunca 2500 rpm’de santrifüj edilmesini hatırlatır ve ardından Simple Western Jess ile protein ayrımı ve immünotespiti aşamasına geçilir.

İpuçları:

• Numune transferine başlamadan önce, protokole kullanıcıyı örnek hazırlamaya yönlendiren bir uyarı eklenebilir.
• VIALAB’ın sade programlama yapısı sayesinde, ikinci kemilüminesans tespit adımı yerine toplam protein analizi eklenerek western blot normalizasyonu kolayca uygulanabilir (kit talimatına göre).

Şekil 3: RePlex kemilüminesans analizi için Simple Western Jess plakasının doldurulma düzeni.