Kan Örneklerinden gDNA’yı Zahmetsizce İzole Etmek için Otomatik DNA Ekstraksiyon Protokolü

URL Kopyalandı

Manyetik boncuklar kullanılarak genomik DNA (gDNA) saflaştırılması, moleküler biyoloji iş akışlarında çeşitli biyolojik örneklerden nükleik asit izolasyonu için sağlam ve çok yönlü bir yöntem sunar. Kandan DNA ekstraksiyonu, onkoloji, hematoloji veya immünoloji gibi farklı alanlarda ileri düzey genomik çalışmaların gerçekleştirilmesini mümkün kılar. Clean Blood & Tissue DNA kiti, yüksek verimli nükleik asit saflaştırması için gDNA izolasyonu amacıyla özel olarak tasarlanmıştır ve tamamen otomatik DNA ekstraksiyon protokolleriyle uyumludur.

Bu uygulama notu, 12 EDTA’lı kan örneğinden gDNA ekstraksiyonu için “walk-away” (kullanıcı müdahalesi gerektirmeyen) bir çözüm sunan INTEGRA’nın otomatik DNA ekstraksiyon protokolünü göstermektedir. Sistem, ASSIST PLUS pipetleme robotu üzerinde paralel olarak birden fazla tüpün güvenilir sıvı aktarımını sağlamak için VOYAGER ayarlanabilir uç aralıklı pipeti kullanır. Ayrıca HEATMAG modülü, otomatik manyetik boncuk işlemlerini kolaylaştırır ve lizis ile elüsyon performansını artırmak için sıcaklık kontrolü sağlar.

Bu protokol, Clean Blood & Tissue DNA kiti kullanılarak manyetik boncuklarla güvenilir ve yüksek verimli gDNA saflaştırması sağlar ve elde edilen gDNA’nın kalitesini aşağı akış uygulamaları için optimize eder.

Temel avantajlar

Clean Blood & Tissue DNA Kiti için geliştirilen otomatik DNA ekstraksiyon protokolü, 250 µl EDTA’lı kandan saf ve yüksek verimli gDNA elde edilmesini sağlar.
Manyetik boncuklarla otomatik gDNA saflaştırması – HEATMAG modülünün benzersiz özellikleriyle birlikte – yıkama sırasında otomatik mıknatıs aktivasyonu ve lizis ile elüsyon aşamalarında sıcaklık kontrolü sayesinde optimum sonuçlar sunar.
Sıvı işleme adımlarında ASSIST PLUS kullanılması, küçük numune setleri işlenirken kullanıcının diğer işlere odaklanmasına olanak tanır.
Optimize edilmiş VIALAB programları sayesinde 24 numuneye kadar esnek kapasite desteklenir ve farklı parti büyüklüklerinde tutarlı ekstraksiyon performansı sağlanır.
Hızlı başlangıç kılavuzları, operatörlerin 6, 12, 18 veya 24 numune için uygulamayı hızlıca kurmasına yardımcı olur; ilgili VIALAB programlarıyla birlikte indirilebilir.
ASSIST PLUS, biyogüvenlik kabini içine sığacak şekilde tasarlanmıştır; bu da kullanıcıların tehlikeli örneklerle yüksek verimli gDNA saflaştırma iş akışını güvenli bir şekilde gerçekleştirmesine olanak sağlar.

Genel bakış: ASSIST PLUS üzerinde kandan gDNA ekstraksiyonunun otomasyonu

Bu uygulama notu, ASSIST PLUS üzerinde Clean Blood & Tissue DNA Kiti kullanılarak 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerindeki 12 EDTA’lı kan örneğinden gDNA izolasyonu için kapsamlı bir otomatik DNA ekstraksiyon protokolü sunar. Protokol, 50–1.250 µl aralığında çalışan 6 kanallı VOYAGER ile hassas otomatik sıvı transferini garanti ederken, HEATMAG modülü sıcaklık kontrollü otomatik manyetik boncuk işlemlerini sağlar.

Otomatik DNA ekstraksiyon protokolünün adım adım süreci Şekil 1’de gösterilmektedir.

Şekil 1: Kandan DNA ekstraksiyonu ve manyetik boncuklarla gDNA saflaştırmasının adım adım gösterimi.

Deneysel kurulum

Şekil 2: 12 EDTA’lı kan örneği için otomatik DNA ekstraksiyon protokolünde ASSIST PLUS deck düzeni.

Pozisyon A: INTEGRA derin kuyucuklu plaka (DWP) (açık mavi: 670 µl lizis karışımı; yeşil: 550 µl Blood DNA Particle Solution; lila: 1.300 µl GH Wash; kırmızı: 1.300 µl TB Wash; turuncu: 340 µl Elüsyon Tamponu).

Pozisyon B: A1–B6 konumlarında 12 örnek tüpü (mavi) içeren HEATMAG modülü.

Pozisyon C: Elüsyon için 12 adet 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü (pembe) bulunan C1 ve C2 sliderları.

Adım adım prosedür

1. Lizis

Kan hücrelerinin lizisi

Lizis karışımını kullanıcı kılavuzunda belirtildiği şekilde hazırlayın: 290 µl TN Lysis + 20 µl Proteinase K. Lizis karışımı için tekil bileşenleri numune sayısıyla çarpın ve ölü hacim olarak 2 ekstra reaksiyon ekleyin (ör. 12 numune için 14 reaksiyon). Hazırlanan lizis karışımını ve Clean Blood & Tissue DNA Kitindeki diğer reaktifleri yeni bir INTEGRA DWP’ye ekleyin. Çözündürülmüş EDTA’lı kandan 250 µl alarak 12 yeni 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve ASSIST PLUS deck düzenini Şekil 2’ye göre kurun.

VIALAB programı “DNA_extraction_from_blood_12samples” seçilip çalıştırılır. HEATMAG modülü 56 °C’ye ulaşmak için ısıtmaya başlar. ASSIST PLUS üzerindeki VOYAGER, 1.250 µl steril, filtreli GRIPTIPS® pipet uçlarını kullanarak her EDTA’lı kan örneğine 310 µl lizis karışımı aktarır. Lizis sırasında, tehlikeli materyallerle çalışırken sıçramayı önlemek için örnekler Hız 3’te karıştırılır. A ve B sütunlarının dönüşümlü olarak karıştırılması, her örneğin iyice homojenize edilmesini sağlayarak optimum lizis koşulları sunar.

İpucu:
Toplam çalışma süresini azaltmak için HEATMAG modülünü önceden 56 °C’ye ısıtın.

2. Bağlanma
gDNA’nın manyetik boncuklara bağlanması

HEATMAG modülü ortam sıcaklığına ulaşana kadar aktif soğutmaya başlar. Aynı anda VOYAGER, homojenliği sağlamak için DWP içindeki Blood DNA Particle Solution’ı 5 kez karıştırır ve ardından her bir lizata 250 µl aktarır (Şekil 3). Blood DNA Particle Solution eklendikten sonra, gDNA’nın manyetik boncuklara etkin şekilde bağlanmasını sağlamak için örnekler sürekli olarak karıştırılır.

Şekil 3: ASSIST PLUS üzerindeki VOYAGER, Blood DNA Particle Solution’ı (a) reaktifleri içeren DWP’den, (b) 24 pozisyonlu tüp adaptörü ile donatılmış HEATMAG modülü üzerindeki lizatlardan oluşan 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerine aktarır.

3. Yıkama
Manyetik boncuklara bağlı gDNA’nın yıkanması

HEATMAG modülü, manyetik boncukları yakalamak için mıknatıs dizisini otomatik olarak başlangıç (home) konumundan yüksek (high) konuma (Şekil 4) getirir ve 10 dakika boyunca bu konumda tutar (Şekil 5). VOYAGER, mıknatıs dizisi aktif haldeyken süpernatantı uzaklaştırır ve ardından sistem başlangıç konumuna geri döner.

İlk yıkama döngüsünü başlatmak için VOYAGER, HEATMAG modülü üzerindeki her bir mikrosantrifüj tüpüne 600 µl GH Wash aktarır. Optimum yıkama koşulları için A ve B sütunları iki aşamada dönüşümlü olarak karıştırılır. Manyetik boncukları tüp duvarından ayırmak amacıyla ilk karıştırma, pipet uçları sabitken boncuk pelletine yakın konumda (x=y= 1,8 mm ofset) gerçekleştirilir. İkinci karıştırmada ise tip hareketi kullanılarak (x=y= -1,2 mm ofset) boncuklar yeniden süspanse edilir.

Operatörden uç kutusunu ve atık kabını değiştirmesi istenir. Operatör onayladıktan sonra yeni uç kutusu başlatılır. HEATMAG modülü, manyetik boncukları 1 dakika boyunca yüksek konumda tekrar toplar. ASSIST PLUS, TB Wash kullanarak yıkama döngüsünü tekrar eder. Süpernatant uzaklaştırılırken yavaş aspirasyon (Hız 1) ve pelletten uzak hassas yükseklik ayarları (x=y= -1,2 mm ofset) boncuk kaybını önler.

İkinci yıkama döngüsünün sonunda, HEATMAG modülü mıknatıs dizisini 24 mm’de düşük (low) konuma kaldırarak manyetik boncukları tüp tabanına daha yakın şekilde toplar. 1 dakika sonra VOYAGER süpernatantı uzaklaştırır ve HEATMAG modülü mıknatıs dizisini 21 mm’de elüsyon yüksekliğine indirir. Ek bir 1 dakikalık inkübasyonun ardından VOYAGER kalan TB Wash’ı aspire eder ve HEATMAG modülü ile 10 dakikalık kurutma adımını başlatır.

İpucu:
Çalışma başlangıcında zamanlayıcıyı 40 dakikaya ayarlayarak uç kutusu ve atık kabının zamanında değiştirilmesini sağlayın.

Şekil 4: ASSIST PLUS üzerindeki HEATMAG modülü (tüp adaptörü olmadan), (a) devre dışı mıknatıs dizisini (başlangıç konumu, 0 mm) ve (b) aktif mıknatıs dizisini (yüksek konum, 29 mm) göstermektedir.

Şekil 5: ASSIST PLUS üzerindeki HEATMAG modülü (tüp adaptörü ve 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri ile), A1–B6 pozisyonlarında (a) yakalanmamış ve (b) yakalanmış manyetik boncukları göstermektedir.

4. Elüsyon
gDNA’nın manyetik boncuklardan elüe edilmesi

HEATMAG modülü mıknatıs dizisini tekrar başlangıç (home) konumuna indirir. Ardından VOYAGER, HEATMAG modülü üzerindeki her bir mikrosantrifüj tüpüne 120 µl Elüsyon Tamponu aktarır. Nominal hacmin %10’unun altındaki pipetlemelerde hassasiyeti sağlamak için ön dağıtım (pre-dispense) adımı uygulanır. Elüsyon tamponunun boncuk pelletine doğrudan yavaşça verilmesi (x=y= +1,8 mm ofset), manyetik boncukların doğru şekilde yeniden hidratasyonunu sağlar.

Her örnek, 100 µl aspire ve dispense edilerek 40 kez karıştırılır ve 65 °C’de 10 dakika inkübe edilir. İnkübasyon sonrasında HEATMAG modülü mıknatısı 24 mm’de düşük (low) konuma kaldırarak manyetik boncukları 10 dakika boyunca toplar. VOYAGER, manyetik boncuk taşınmasını önlemek için Hız 1’de 110 µl elüatı aspire eder ve bunları Slider C1 ve C2’deki karşılık gelen boş 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerine (Şekil 2; pembe) aktarır. Çalışma tamamlandığında operatör bilgilendirilir.

İpucu:
Örnek seyreltilmesi tercih edilirse elüsyon hacmi 200 µl’ye çıkarılabilir.

Sonuçlar

Tam kandan yetersiz gDNA saflaştırması, qPCR ve NGS gibi aşağı akış moleküler biyoloji uygulamalarını olumsuz etkileyebilir. Bu uygulama notu, 50–1.250 µl aralığında çalışan 6 kanallı VOYAGER kullanılarak, ASSIST PLUS üzerindeki HEATMAG modülü için optimize edilmiş INTEGRA’nın otomatik DNA ekstraksiyon protokolü ile birlikte Clean Blood & Tissue DNA Kitinin etkinliğini göstermektedir.

Bir kan bankasından sağlanan EDTA’lı kan örnekleri, en fazla 3 gün boyunca 4 °C’de saklanmıştır. Aynı kan grubuna ait 10 farklı donörden alınan tüpler birleştirilmiş (pool), alikotlanmış ve kullanım anına kadar dondurulmuştur. Her çalışmada, qPCR performansını doğrulamak ve olası inhibisyonu dışlamak amacıyla 240 µl kan ve 10 µl DNA spike-in kontrolü içeren 12 mikrosantrifüj tüpü kullanılmıştır. DNA verimi ve saflığı spektrofotometri (DeNovix DS-11 Serisi) ile analiz edilmiş, qPCR performansı ise QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific) cihazı ile değerlendirilmiştir.

ASSIST PLUS üzerinde Clean Blood & Tissue DNA Kitinin performansı; elüatın 1/10 dilüsyonlarında elde edilen verim, saflık oranları ve qPCR analizleri ile değerlendirilmiştir (Şekil 6). Otomatik DNA ekstraksiyon protokolü ortalama 5,4 µg gDNA verimi sağlamış, ortalama saflık oranları A260/280 için 1,9 ve A260/230 için 2,0 olarak bulunmuştur (Şekil 6 a–c). Ayrıca qPCR analizleri, 1x–10x ve 10x–100x seyreltilmiş DNA girdileri için sırasıyla 3,3 ve 3,5’lik tutarlı Ct artışları göstererek inhibisyon olmadığını ortaya koymuştur. Numuneler arasında tutarlı qPCR performansı, otomatik DNA ekstraksiyon protokolünün sağlamlığını ve güvenilirliğini doğrulamaktadır (Şekil 6 d–e).

Şekil 6: Clean Blood & Tissue DNA Kiti ile kandan yüksek verimli gDNA saflaştırması. Hata çubukları standart sapmayı göstermektedir (n=36). Ayrıntılı veriler ek bölümde bulunabilir.

(a) Toplam DNA verimi.
(b) A260/280 oranları için OD değerleri.
(c) A260/230 oranları için OD değerleri.
(d) Ct değerleri.
(e) Tek bir 12 örnek çalışmasına ait amplifikasyon grafiği: seyreltilmemiş (yeşil), 10 kat seyreltilmiş (açık mavi) ve 100 kat seyreltilmiş (turuncu) elüatlar.

Notlar

VIALAB yazılımı: VIALAB programları, kullanıcının pipetine, laboratuvar ekipmanına (labware), modüllerine ve protokollerine özel olarak hızlıca uyarlanabilir.
HEATMAG modülü: VIALAB içindeki mıknatıs adımı, mıknatıs dizisinin hassas şekilde kontrol edilmesini sağlar ve kullanıcıların 0 ile 29 mm arasında özel yükseklikler ayarlamasına olanak tanır. Ayrıca sıcaklık, her adım için VIALAB üzerinden oda sıcaklığından 65 °C’ye kadar kontrol edilebilir.

Sonuç

Yüksek verimli gDNA saflaştırma iş akışı, ASSIST PLUS üzerinde HEATMAG modülü ile birlikte Clean Blood & Tissue DNA Kitine ait otomatik DNA ekstraksiyon protokolü kullanılarak 240 µl EDTA’lı kandan yaklaşık 5,4 µg gDNA elde edilmesini sağlamıştır.
ASSIST PLUS üzerindeki VOYAGER ve HEATMAG modülü ile hassas sıvı ve manyetik boncuk yönetimi, güvenilir sonuçlar sağlayarak yüksek veri kalitesini garanti eder.
Elde edilen gDNA’nın saflığı – yaklaşık A260/280 oranı 1,9 ve A260/230 oranı 2 – proteinler veya organik kirleticiler (ör. fenol, guanidin, tuzlar) gibi kontaminantların bulunmaması sayesinde optimum qPCR performansı sağlar.
24 örneğe kadar otomatik işlem kapasitesi, manuel müdahale süresini azaltır ve verimli bir iş akışı sunar; böylece küçük numune grupları örnekler ulaştığı anda işlenebilir ve sonuç elde etme süresi kısalır.
Optimize edilmiş VIALAB programları, farklı numune sayılarında yüksek derecede tutarlı ekstraksiyon performansını destekler. 6, 12, 18 ve 24 numunenin işlenmesine ait ayrıntılı veriler ek bölümde sunulmuştur.

Kaynak: https://www.integra-biosciences.com/global/en/applications/automated-dna-extraction-protocol-effortlessly-isolate-gdna-blood-0